VHCDR3基因文庫與VL基因的擴增

[器材和試劑]

● PCR試劑和設備

● Geneclean試劑盒（Qbiogene）

● VHFOR隨機引物（見下文），10pmol/ul

● LMB3引物

● VHBACK引物； 5,-TTT GAC TAC TGG GGCCAG GG-3', 10pmol/u1

● FdSEQ 引物： 5'-GAA TTT TCT GTATGAGG-3',10pmol/ul

● 含起始scFv基因的質粒DNA

[方法]

1.設計并合成含有CDR3隨機化序列的VHFOR引物。當然必須以擬進行親和力成熟的抗體VH基因作為設計的基礎。本例中，VHCDR3的7個氨基酸被隨機化。在每個隨機化位點中，保留了大約50%野生型氨基酸。引物設計結果如下：

VHFOR隨機引物： 5'-CC CTG GCC CCA GTAGTC AAA 532 511 532 544 524 534 514 TTT CGC ACA GTA ATA AAC GGC-3,

隨機化了7個連續的CDR殘基。根據試驗結果，我們可以得出以下結論：只有當溶劑可接近殘基突變時，序列空間才能被更有效地利用。采用分子建模可以識別出這些殘基。本例中隨機化殘基的選擇就是根據分子建模的方法預測哪些殘基具有溶劑可接近側鏈的。

2. 配制2個50ul PCR反應混合液，1個用于VH基因的擴增。另1個用于VL基因的擴增，包含：

● 水，35.5ul

● 20XdNTP, 2.5ul

● 10XVent聚合酶緩沖液，5.0ul

● 反向引物（10pmol/ul），2.5ul

● 正向引物（10pmol/ul），2.5ul

● scFv基因模板DNA（100ng），1.0ul

● Vent DNA聚合酶（2單位），1.0ul

3. 在有加熱蓋的熱循環儀內加熱試管到94℃5分針。以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃ 2分鐘的條件共循環30次，擴增V“基因和Vl基因。

4. 用1.5%瓊脂糖膠純化Vu基因丈庫[350個堿基對（bp）]和VL基因 （320bp）；用 Geneclean試劑盒提取0NA.將每種產物重懸于30ul水中。在1.5%瓊脂糖凝膠上與已知大小和農度的標準對照品比較，測定DNA濃度。