ValaKIC高內涵細胞分析儀助力心衰竭靶向miRNA篩選及機制..

Vala KIC高內涵細胞分析儀助力心衰竭靶向miRNA篩選及機制研究

心力衰竭是各種心血管疾病的頂峰，包括高血壓、缺血性疾病和動脈粥樣硬化，瓣膜病功能不全、心肌炎和收縮性蛋白突變及收縮功能逐漸喪失為特征的。普遍的治療策略是阻斷腎素-血管緊張素和交感神經系統的有害作用 ，但目前的藥物很少是靶向衰竭心肌細胞機制的， 因此迫切需要開發新的藥物，特別是用于治療患者晚期心力衰竭的藥物 。復雜的細胞內網絡可以平衡與工作復核相關的收縮力和細胞內Ca²⁺處理能力；然而，miRNAs在心臟收縮性中的作用仍然很大未開發，miRNA幾乎對所有正常和病理過程都可微調，并通過下調占據關鍵節點的蛋白質生物控制網。因此我們推測心衰竭時，miRNA的抑制收縮能力會上調，可能用作治療干預的新靶點。                        

鈣轉運的ATP酶SERCA2a是鈣攝取的主要機制。心肌細胞興奮-收縮偶聯過程中，SERCA2a的表達降低及活性減少導致鈣攝取損傷是心衰竭的重要標志，通過基因轉染恢復相應的SERCA2a被證明能有效的提高動物模型中和臨床實驗中的心衰竭的關鍵性參數， 因此，miRNAs下調SRCA2a，心衰竭可能升高，心臟功能會受損。

為了找到心衰竭靶點miRNA，斯坦福大學伯明翰醫學院及加州大學的老師發現因通過計算機算法預測了300多個靶向SERCA2a的miRNA，結果容易出錯，需要進行經驗評估，因此借助Vala 公司的KIC高內涵超高成像速度，逐孔單細胞鑒定分析的高通量分析技術，對全基因組中能下調鈣離子泵的miRNA 做了篩選分析，同時對篩選到miRNA對鈣的影響做了實時追蹤分析，最終發現miR-25 通過下調SRCA2a導致心衰竭，抑制miR-25可以提高心臟收縮功能修復心衰竭，并將結果在Nature 的letter上發表文章《Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart》

實驗

利用Vala KIC超高速高內涵細胞分析系統篩選收集了整個基因組中可以選擇性下調鈣泵的整個miRNA庫，篩選時將ERCA2a mRNA39 3’非編碼區下游與增強型綠色熒光編碼區融合，構建了一個靶向感應器用于檢測miRNA的活性通過變低的eGFP的信號(Fig. 1a, b)，通過Vala公司的KIC 高內涵分析系統超高成像速度及每孔逐個細胞的分析及統計功能進行篩選，結果顯示144個miRNA減少了30%的熒光, P<0.05 (Fig. 1c, d)，并且82個miRNA通過劑量測試被證實(Fig. 1e, f and Supplementary Table 1).，32個是進化保守，15個進化保守并且在心衰竭中上調，4個在HL-1心肌細胞中導致了顯著的鈣瞬時衰減的單尾方差延長，顯示持續時間從75%到25%的最大值（CAD75—25），并且發現最有效的miRNA 是miR-25，其相對siRNA直接靶向SERCA2a, siSERCA2a， miR-25引發了顯著的生理效應，并證實，miR-25在心衰竭的病人樣本中表達上調，原位雜交顯示miR-25主要表達在主動脈縮窄誘導的心衰竭心肌細胞中，在心肌纖維或血管外皮細胞中不表達，在血管平滑肌細胞中不表達（Fig. 2)。

 

Figure 1 | High-content screening identifies miRNAs that control SERCA2a. a, b

Figure 2 | Endogenous miR-25 expression in the heart

為了建立miR25與心臟功能之間的聯系，我們鑒定了通過計算法推斷的Ca²⁺處理相關蛋白， HL-1細胞中篩選的蛋白除了SERCA2a，還包括IP3R1,其被瞬轉的miR-25選擇性下調，及其他轉染miR-25后不受影響的鈣處理蛋白，包括鈉鈣交換體（NCX1，也稱為SLC8A1），鈣調素激酶2（CaMKII）、磷蛋白（PLN）和鈣調和3（CALM3），(Extended Data  Fig. 2），miRNA通過不精確堿基配對的特異元件與同源mRNA結合 。通過TargetScanHuman v.6.2分析，單個推斷的miR25識別區在SECA2A和IP3R1 39 UTR序列中之間。這些突變的序列消除了miR25對報告體表達的抑制 ，這進一步支持了篩選出的miR25與mRNA的相互作用，并暗示了SERCA2a和IP3R1 mRNA被鑒定的3’UTRS端的識別元件足夠滿足miR-25的活性。

Extended Data Figure 2 | Effect of miR-25 on calcium handling proteins

已經顯示miR-25能調節SERCA2a及IP3R1，之后利用Vala 的KIC高內涵分析系統，對培養了72小時的細胞，在1赫茲的情況下，加上5ms的15V電脈沖，在2秒時開始記錄，以33fps的拍攝速度，對每個孔的單個細胞進行鈣流實時拍攝， 測試了是否siRNA直接作用這些蛋白能夠模擬體內miR-25對鈣瞬時動力學的影響；結果統計發現，在新生大鼠心室心肌細胞和HL-1細胞中，相對自發的收縮，SERCA2a轉染大大降低了瞬時（CaTD75–25）的衰減階段（Ca²⁺重吸收），然而Ca²⁺瞬時向上的最大上升速率沒有受到影響，精確地再現了miR-25的作用，并在從衰竭的人心臟中分離出的心室肌細胞中模擬出了1.5-2倍的衰減下降。在HL-1細胞，抗IP3R1的siRNA對Ca²⁺瞬時動力學影響非常小 ，而對NRVCS（CAD50、CAD75—25和Vmax ）完全不影響，表明miR-25對Ca²⁺的瞬時動力學的調節主要是通過下調SRCA2a的表達實現，Vala KIC 高內涵精確的數據分析，科學準確的闡述了miR-25在心肌收縮過程中的機制，為心衰竭的治療找到了靶點。

Extended Data Figure 1 | Effect of miR-25 on IP3R1 and cardiomyocyte calcium transients in vitro