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  • 發布時間:2020-07-07 14:32 原文鏈接: Vero細胞在WAVE反應器中的微載體球轉球放大(五)

    相比攪拌罐而言,WAVE 反應器在同一個培養袋中可以有更寬的培養范圍(10-100%工作體積),對于種子擴增和細胞消化的不同反應體積,都可以提供均勻有效的混合,從而實現微載體的原位消化,而無需特定的消化反應器。避免了消化前后微載體的轉移,操作簡單,均勻有效的混合有利于精密控制消化反應的條件,最大程度保證細胞的完整性和回收,成為微載體球轉球成功放大的關鍵。

     

        球轉球實驗 B2B  #4 和#5 的結果提示,球轉球進行高倍率放大也完全可行,放大倍率可以達到十倍,前提應該是讓種子培養達到足夠的細胞密度以保證能有足夠多的細胞進入下一步培養。足夠的細胞接種密度,以及細胞數和微載體表面積的比例兩者共同保證了細胞的有效貼壁并快速進入生長期。而我們的實驗表明,球轉球后微載體表面積或者是培養體積的在小范圍內的變化均不會對細胞的貼壁和生長產生太大的影響。

     

        我們在這里所描述的幾次球轉球實驗均是把一部分舊的微載體同細胞一起轉移來完成的。從各次球轉球實驗前后細胞在微載體上生長的形態來看,細胞能在微載體上均勻地分布。因此,舊的微載體同細胞一起轉移并不影響細胞貼壁到新的微載體上。如果不和舊的微載體一起轉移的話,就需要把細胞和微載體分離。這就意

    味著需要額外的步驟和較長的工藝時間。這些額外的步驟還需要更多復雜的設備因而也增大了污染的風險。由于細胞沒有在微載體上不均勻的分布或更集中于舊微載體的情況,我們認為沒有必要把細胞和舊的微載體分開。

     

    結論

     

        通過在瓶子里或直接在細胞培養袋中進行的細胞和微載體分離的方法,WAVETM 反應器中的球轉球實驗能夠成功地進行。且放大倍率可以很容易地達到十倍。轉移之后 Vero 細胞能保持和種子細胞相似的生長特征。生長在微載體上的Vero 細胞用 37℃預熱的 PBS-EDTA 洗滌,用 37℃預熱的胰酶進行處理,胰酶處理的時間不超過40分鐘。轉移過程中沒有必要把細胞和舊的微載體分開。

     

        WAVE 微載體球轉球技術為微載體細胞培養的規模放大提供了可靠支持,該技術可以在同一個培養袋中實現原位消化,然后直接轉移到更大規模的 WAVE 反應器中重新貼壁擴增而無須使用單獨的消化反應器,消化條件容易控制,設備投資成本低;無菌焊接機和封口機配合細胞培養袋可以方便的實現無菌管道化封閉生產,不僅操作簡單避免污染,同時防止操作人員對病毒的暴露,實現更加安全的生產操作。因此,WAVE 生物反應器進行規模化微載體細胞培養可以取代繁冗的轉瓶和多個小規模反應器的培養工藝,成為疫苗規模化大生產的發展趨勢。

     

    參考文章

    [1]. History and Characterization of the Vero Cell Line -- A Report prepared by CDR Rebecca  Sheets, Ph.D., USPHS CBER/OVRR/DVRPA/VVB for the Vaccines and Related Biological  Products Advisory Committee Meeting to be held on May 12, 2000 OPEN SESSION www.fda.gov pdf

    [2]. Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain  induces cross-protective immune responses. Kistner O, Howard MK, Spruth M, Wodal W, Bruohl  P, Gerencer M, Crowe BA, Savidis-Dacho H, Livey I, Reiter M and others. 2007, Vaccine 25(32):6028-6036.

    [3]. Flu Vaccine Race Against The Clock. Thayer AM. 2009, Chemical & Engineering News, September 28, 2009, 87(39), p27-33

    [4]. A novel mammalian cell (Vero) derived influenza virus vaccine: Development, characterization and industrial scale production. Kistner O, Barrett PN, Mundt W, Reiter M,  Schober-Bendixen S, Eder G, Dorner F. 1999. Wiener Klinische Wochenschrift 111(5):207-214.

    [5]. High immunogenic enterovirus 71 strain and its production using serum-free microcarrier Vero cell culture. Liu CC, Lian WC, Butler M, Wu SC. 2007. Vaccine 25(1):19-24.


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