DDDD.顯色目的條帶又細又淺，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD
的c-myc，應該是高表達。每個涌道上50-70μg蛋白，開始用半干轉移，后來用濕轉14v，16h，用PVDF膜轉移。膠轉移后染色檢測，發現小分子量的基本轉移走了，可是為什么條帶老是不粗不濃呢?
解答：可能跟你的一抗有關系，還有應該高表達，那實際做的陽性對照是否是高表達；還有跟抗原量相關，你多上點蛋白會好的多；跟顯色條件相關。
EEEE.背景很花，當然條帶也很淡，如果我在顯影液中多洗一會兒，背景就很深，以致無法辨認，但有時條帶又很明顯，背底很淡。
解答：這跟你washing的時間和強度有關，很可能你在這方面沒有掌握好。顯影時間是有范圍的，久了肯定不行。
FFFF.純化過的目的帶包括其上下都出現了色帶，而且對照菌也出現了條帶，會是什么原因?
解答：一抗有問題，效價太低，且未純化；表達量太低；提蛋白時可能出了問題。
GGGG.做Western Blot的檢測的時候，用DAB顯色還能看出條帶，但是換成ECL的時候什么樣結果都沒有。我用的NOVA公司的發光底物，膠片是普通的X片，定影液和顯影液都是別人留下來的，不知道是什么原因？
解答：一般的說，Ecl比DAB更靈敏，但是DAB是HRP最敏感的底物，所以有幾種可能：
ECL底物失活了，你可以檢測一下；敏感度正好不到ECl底物的范圍。DAB能顯色可不能催化ECL底物；顯影液沒用了。
HHHH.怎樣分析結果，需要什么軟件?
解答：如果你做定量或辦定量，至少要用到一個光密度掃描分析軟件，如果不是，直接分析就可以了。
IIII.積層膠、分離膠一般多少左右合適？
解答：一般電泳是積層膠60-80v，分離膠100v。
JJJJ.采用生物素標記的二抗－SABC-DAB檢測系統做western，非特異性的條帶和背景高？總蛋白考染的時候發現接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起了，這是什么原因，如何解決？sds－page的時候恒壓和恒流哪個好？
解答：非特異性的條帶和背景高：可能性太多了，一抗，二抗，封閉的原因都可能。
總蛋白考染的時候發現接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起了，這是什么原因，如何解決？正常的，另外，是否是你的積層膠有問題。sds－page的時候，恒壓和恒流都可以用。
KKKK.血清樣品進行Western Blot 分析，目的蛋白21kD，結果顯色出來后，目的條帶很淡，而白蛋白和IgG條帶很濃？
解答：可能是因為白蛋白為67kD和目的蛋白相差教大，且他的濃度較低，你可以以底物二氨基聯苯胺和0．01％過氧化氫溶液顯色的時間延長為30分鐘，再用去離子水漂洗以終止反應;也可能是抗體的特異性不好。把封閉的時間延長，同時提高封閉液的濃度，可以減少以下背景噪音。同時洗的時候要徹底，而目的條帶弱，說明濃度不足，如果不考慮后續功能的話，你可以過G-50（細）柱子，純化你的靶蛋白，接著真空冷凍濃縮，可以得到很漂亮的結果。
LLLL.Western轉膜已經成功了，但是Marker泳道未見蛋白條帶（正常應該有6條），其余各泳道均有清晰的蛋白條帶，經考馬斯亮藍染膠，結果相同。經5％的脫脂牛奶封閉1小時45分鐘后，進行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過夜，二抗孵育5個半小時（1：2000），均在室溫下，DAB顯色，雖出現蛋白條帶，但較弱，且出現非特異性條帶。請問：1、Marker是MBI公司的，可分離14-116KD的蛋白，買了大概有一年的時間，是否有問題？2、一抗（為多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時間是否合適？
3、封閉的時間是否太短？
解答：1. marker 有可能被降解了， 也有可能是它標稱的上樣量太少，不夠，我做過一個標稱每次5ul可我上了20ul才行的。
2.建議，一抗4度過夜也很好， 建議1:100，室溫2hrs就夠了，
3. 二抗室溫1小時，1:2000，我喜歡4度封閉過夜（室溫2hr就夠了），1抗室溫1hr，2抗室溫1hr，最好是一抗4度過夜（或室溫2小時）1:200，2抗室溫1小時1:2000， 換ECL法。