膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調整濃度。
抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時間。
1）酶失活，建議直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物。
2）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關文獻確定。
3）標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設置陽性對照比對結果，增加標本上樣量。
