哈哈,深蒙各位俠士對于兄弟的厚愛和信賴,恐怕我會令大家失望
真正做western我也做的不多,不過由于效果都不是很差,所以就對于整個過程中的某些參數對于結果的影響沒有深究,正所謂真正經歷實驗失敗的人才會對具體細節理解深刻一樣,但是從關于western方面的文獻和資料來看,有關各個參數對于結果的影響是有高質量的paper闡述的,所以大俠們的這些問題和想法個人認為完全是可以做出一篇小論文評述的
這兩天剛好有些時間,就把曾經看的資料都大致再看了一下,自己總結了一下,可能仍然對上述大俠們的問題沒有滿意的解釋,但可能會對大家的理解帶來些許的幫助,也希望大家能提出意見和建議,在你們這些大俠面前獻丑真是不好意思!
首先有必要對整個蛋白電泳的背景有些了解:
如今實驗室中用的最多的蛋白電泳是源于Lammli于1970年發表在nature上的一篇文章中的方法,這篇文章很特別,不僅被引用的次數較多,而且該篇并不是專門闡述蛋白電泳方法上的提出和改進問題,而是對噬菌體頭部包裝過程中的蛋白進行分析過程中用到電泳分析方法而已,所以闡述如何操作的文字只有那么一小段(但相當經典),這是SDS-PAGE(不連續系統)的首次成功應用,現在我們在實驗室進行的SDS-PAGE試劑的配方仍然是沿用了它的數據,其實任何技術都不是平白無故的提出并實踐的, Lammli提出的方法也不例外.早在1964年,Ornstein和Davis在Annals of the New York Academy of Sciences上各自發表了一篇關于圓盤電泳(Disc electrophoresis)的paper,這兩篇paper首次提出了不連續的Native PAGE系統;而在1967年,Shapiro在Biochemical and biophysical research communications上的一篇paper中首次進行了連續的SDS-PAGE,以磷酸鈉為緩沖體系(pH7.0),內含0.1%SDS,在樣品溶解液中加入了1%SDS及!%巰基乙醇,37℃保溫3h然后上樣電泳.正是這兩篇paper的指引下(當然還有其它的參考文獻),Lammli總結了前人的智慧結晶下提出并成功運用了不連續的SDS-PAGE系統.
說了半天似乎沒有回到大俠們的問題上來啊,呵呵,問題的解釋已經顯露出來,最初樣品進行變性處理的時候Shapiro用的是37℃保溫3h(之后的文獻就是用這樣的加熱方法),而在Lammli的報道中用的是沸水浴中1.5分鐘,而在另外的文獻中有用60-70℃30分鐘,95℃4分鐘等等.我們知道蛋白質溶液中加入SDS和巰基乙醇(二硫蘇糖醇,DTT也可),SDS主要通過疏水作用與蛋白結合,一定的SDS單體濃度下,大約結合比例為1.4g SDS/1g蛋白(引自PNAS,1970,66,1002-1007,作者是Reynolds),而巰基乙醇使蛋白二硫鍵還原,有利于蛋白質與SDS的結合,蛋白樣品被加熱變性能使SDS與蛋白充分結合.其實加熱不是問題的關鍵,比如上述的Reynolds等人制備SDS-protein樣品的方法是用先用鹽酸胍處理,以得到蛋白多肽的無規卷曲構象(random coil conformation)然后用含SDS與巰基乙醇的緩沖液進行透析,文中還指出,若是省去鹽酸胍這一處理步驟,直接將蛋白用含SDS與巰基乙醇的緩沖液進行透析能得到一樣的結合率(約1.4g/1g),同樣在Reynolds的另一篇文獻中(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,1970,245,5161-5165,說明一下,正是這篇研究闡述了SDS與蛋白的結合比例約為1.4g/1g)有這樣的一段話:
Preparation of Protein-SDS complexes
Protein was dissolved in 6 M GuHCl and 0.1% beta-mercaptoethanol to obtain polypeptide chains in the random coil conformation . The GuHCl was
then removed by dialysis against H20 containing a reducing agent.
SDS, P-mercaptoethanol, and the appropriate buffer were dialyzed into the bag containing the protein solution. The amount of bound SDS and the concentration of protein were determined as described previously . It has been demonstrated that the same final binding ratio is reached when the complex is obtained by the above procedure as when it is formed by treating the native protein directly with SDS and beta-mercaptoethanol. Protein-
SDS complexes were formed by both procedures and compared in the experiments reported here.
所以處理的方法不管用37度保溫3h,還是100度1.5min一般來說效果(形成SDS-protein復合物從而完全掩蓋蛋白自身的電荷差別而使泳動率只是分子量的函數)差不多,其實可以做做這方面的實驗,看哪種參數下的SDS-PAGE效果最好
我只是單單從SDS-PAGE方面給出的分析,蛋白電泳這一步做好了,western就成功一半了,至于顯影方面那是涉及western具體操作上的問題,如電轉移效率,顯影背景如何降低等等,我能做的就到此了,至于再更加深入已經不是我能把握的了了!
用得上的頂一下！不要吝惜呀！！