三類X 射線光源：實驗室X 射線光源(X 射線管)、直線加速器和同步輻射裝置。同步輻射是既近平行又高強度，且波長可調而成為最理想的光源。未見有將直線加速器用于X 射線顯微鏡，實驗室光源有使用的，但不能用焦點在10 mm×1 mm 左右的封閉X 射線管，可以用高功率的旋轉陽極X 射線管。另外，可用焦點尺寸在數十微米的細聚焦X 射線管，該管焦點小，但光亮度大，可達2×1011~1.2×1012 photos/s · sr，已接近同步輻射的光亮度，而且功耗很小，一般只有數十瓦，整機體積也小，適合作為實驗室X 射線顯微鏡的光源。此外，還有用等離子X 射線源的。
從光源發射出的X 射線一般需先經聚焦使光斑進一步縮小，光亮度進一步增加才照到樣品上。總的來說，實驗室光源的光亮度比較低，儀器的分辨力也低，故實驗室X 射線顯微鏡應用面不廣，而同步輻射顯微鏡卻發展得很快，做出了許多很有價值的工作。