PCR產物的TA克隆
TA克隆 系統可以用于快速地、一步到位地把PCR 產物直接插入到質粒載體的多克隆 位點（MCS）中。實驗方法原理PCR產物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR 產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR 產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR 產物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴增出來的PCR 產物已經是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。粘頭連接也可以大致分為兩類，一類粘頭連接是用某種方法，在載體和P......閱讀全文
克隆PCR產物的最優條件是什么？
最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液，50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫
快速TA克隆的突破
快速TA克隆的突破T載體是TA克隆載體的簡稱，就是利用載體的T末端和PCR產物的A末段連接而將目的基因克隆到載體中的方法。目前市場上常見的T載體，根據連接方法可以分成兩種：方法1、以T4連接酶進行連接的方法，這種方法的載體有promega、takara；可以說這兩家公司將這兩種方法發揮到了很高的水平
iPCR或混合PCR產物的SLIC亞克隆
實驗概要SLIC（Sequence and Ligation Independent Cloning）是一種不依賴于基因序列和連接反應的高效基因克隆新方法，它可以實現體外同源重組反應中多個DNA片段在單一反應中的裝配和單鏈的退火。實驗步驟1. 用限制性內切酶處理2微克載體，使用QIAEX II凝膠提
克隆化的PCR產物連入T載體
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graha
克隆化的PCR產物連入T載體
由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。本實驗來源「分子克
PCR擴增產物的克隆技術1
利用各種PCR技術擴增特異DNA是獲得目的基因和特異探針的一種最有效、最簡便的方法。但PCR擴增出的片斷如不經進一步克窿是無法變成可利用基因，因此PCR擴增產物的克窿技術是DNA重組技術中的一個最重要部分，該技術是目前分子生物學實驗中最重點內容，要綜合前面實驗中所介紹的各種技術，起著承上啟下的作用。
克隆化的PCR產物連入T載體
實驗方法原理 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991
PCR擴增產物的克隆技術2
T－載體的構建一：儀器：同質粒DNA提取實驗、酶切實驗及RT－PCR實驗二：試劑：SmaI、其余同質粒DNA提取實驗、酶切實驗及RT－PCR實驗三：操作：1：提純載體DNA2：將1ug提純的PGEMDNA用SmaI1ul進行全酶切（為了切割徹底、甚至能破壞酶切位點周圍堿基序列而防止自連發生，酶可過量
PCR擴增產物的克隆——平端連接法
PCR擴增產物的克隆可以：（1）獲得目的DNA片段；（2）用于原核表達的研究；（3）廣泛應用于分子生物學相關研究。實驗方法原理平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用
PCR產物的克隆（平頭連接和粘頭連接）
PCR產物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR 產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR 產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求
關于克隆PCR產物的對照實驗相關介紹
A）涂布未轉化的感受態細胞。 如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。 B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。 例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋，1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過夜，
TA克隆常見問題分析
現象可能原因解決方案 轉化后無菌落生長 感受態細胞已經失效用pUC18質粒進行轉化，確認細胞的感受態效率。1ng pUC18質粒至少應得到1000個以上的轉化子。如有問題，重新制備感受態細胞。 平板所用抗性不對pBS-T載體為amp抗性，工作濃度 100 ug/ml 連接中使用了不恰當的vector
你真的了解－TA－克隆嗎？
首先，TA 克隆是用于 PCR 產物的克隆和測序。原理是利用 Taq 酶能夠在 PCR 產物的 3’末端 加上一個非模板依賴的 A，而 T 載體是一種帶有 3’T 突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把 PCR 產物直接插入到質粒載體的多克隆位點中。?那么在你做 TA 克隆時，需要準
Cloning－PCR－products－using－TA－vectors
Cloning PCR products using TA vectorsby Paul N. Hengen, Ph.D.?*Methods and reagents is a unique monthly column that highlights current discussions in
TA克隆常見問題及解決方案
TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片斷與一個具有3-T突出的載體DNA連接起來的方法。因為PCR反應中所適用的聚合酶具有末端轉移的活性，通常在3加上A。例如：Taq聚合酶同時具有的末端連接酶的功能，PCR反應時在每條PCR擴增產物的3端自動添加一個3-A突
PCR技術（十六）：PCR產物測序
PCR技術代替了為測序而反復進行的分子克隆和模板制備步驟。PCR技術與自動測 序技術相結合后，它將成為一種最快、最有效的測定核苷權序列的方法。本章主要綜 述各種測模板的制備以及如何完成PCR產物的直接測序。與傳統的將PCR片段克隆入質 粒或病毒基因組相比，直接序列分析有兩個主要的優點:1)由于它是一
聚合酶鏈式反應（PCR）擴增和擴增產物克隆
?PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟：(1) 變性(Denature)：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈；(2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過
聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆
概 述? PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上
聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆
第一節 概 述?PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃
TOPO?－快速克隆技術介紹
Topo TA克隆方法（Topo TA Cloning Kit）???? Topo TA克隆原理與TA克隆一樣，唯一不同的是TA克隆用的是T4連接酶把PCR片斷連接到T載體上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。???? Topoisomerase的用途一般使用
PCR產物的電泳檢測
PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。常見問題如下：????一、假陰性，不出現擴增條帶????PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，?④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。????模板
PCR產物的直接純化
實驗概要本實驗介紹了PCR產物直接純化的原理及操作步驟。實驗原理PCR產物一般都含有過量的引物、Taq ? DNA酶及dNTP，這些成分的存在將直接影響到后續的酶切、雙脫氧PCR測序反應等過程，因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多，商用化試劑盒的出現使得DNA的純化過程變得更加簡便快捷。本實驗中
PCR產物的電泳鑒定
一、準備工作1、實驗器具與材料：（1）移液槍：10ul（2）吸頭：20ul（3）吸頭臺：放置200ul和20ul的吸頭一個（4）三角燒瓶：50ml一個（5）瓊脂糖2、實驗器具的處理與準備（1） 塑料制品：（包括吸頭等）送至高壓3次，試驗前將槍頭放入吸頭臺。（2）電泳板及電泳槽：用自來水沖洗干凈備用3
PCR產物的回收純化
PCR產物的回收純化的目的是：高質量DNA；除去蛋白（如酶等），RNA，無機鹽（NaCl超過150 mM對T4連接酶有抑制作用），小于100 bp的短片段（如引物DNA），有機小分子（如dNTP、Agrose、EB、甘油、礦物油）。
PCR產物的電泳鑒定
一、準備工作1、實驗器具與材料：（1）移液槍：10ul（2）吸頭：20ul（3）吸頭臺：放置200ul和20ul的吸頭一個（4）三角燒瓶：50ml一個（5）瓊脂糖2、實驗器具的處理與準備（1） 塑料制品：（包括吸頭等）送至高壓3次，試驗前將槍頭放入吸頭臺。（2）電泳板及電泳槽：用自來水沖洗干凈備用3
PCR產物污染誘因
PCR反應的zui大特點是不僅具有較大擴增能力而且還有著極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因（1）標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，
PCR－產物定量實驗
測序之前對模板精確定量至關重要。根據 DNA 用量的多少，有幾種不同的方法可供選擇。下面介紹另外兩種方法：熒光測定法和比較溴化物染色法。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試劑、試劑盒DNA 標準TEPCR 產物儀器、耗材熒光計金屬箔紙微量離心管實驗步驟方法 A: 熒光測定
PCR－產物純化實驗
介紹一個采用 AmiconMicrocon-PCR 濾件（Millipore) 的方法，有效地去除冗余dNTP 和引物的方法純化 PCR 產物。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試劑、試劑盒TE 或去離子水PCR 產物儀器、耗材離心機和轉子PCR 濾 件微量離心管實驗步驟
PCR－產物純化實驗
試劑、試劑盒 TE 或去離子水PCR 產物儀器、耗材 離心機和轉子PCR 濾 件微量離心管實驗步驟 一、材料1. 緩沖液和溶液TE(lOmmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH7.5) 或去離子水2. 核酸和寡核苷酸待測序的 PCR 產物3. 離心機和轉子帶有固定傾角轉子的小型
PCR－產物純化實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 TE 或去離子水 PCR 產物 儀器、耗材 離心機和轉子 PCR 濾 件