NatureMethods|向陽飛等建立功能性血管狀系統類腦器官

　　如果說宇宙蘊藏無數奧秘，那么大腦必定是其中最難解謎團之一。對人類大腦的研究不僅關乎我們對人體內這一最復雜器官發育與功能的理解，相關的病理學、藥物發現、再生醫學等研究更是與國計民生直接相關。基于干細胞、發育生物學、生物材料等多學科理論與技術的類腦器官近年來發展迅速，為研究人類大腦發育、功能、疾病乃至進化等提供了重要的技術平臺。類腦器官一般以多能干細胞（如胚胎干細胞或誘導多能干細胞）為來源，通過三維培養過程，使其能夠在體外從時間、空間的維度重構大腦的細胞構成、組織結構與功能。自約六年前類腦器官被首次報道起，全球范圍內多個課題組對類腦器官開展了深入地開發、優化研究；同時，類腦器官也被廣泛應用于研究多種生物學和醫學問題【1,2】。作為一門新興技術，類腦器官仍有諸多不足尚待改進。其中一個重要的難題即是如何在類腦器官中重構血管系統，從而改善在長期培養過程中類腦器官的發育，并為研究血腦屏障提供支持。

　　2019年10月7日，來自耶魯大學干細胞中心In-Hyun Park研究組（Bilal Cakir博士和向陽飛博士為共同一作）在Nature Methods雜志發表了題為Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system的文章，在其前期研究的基礎上【3-5】，利用人類胚胎干細胞建立了具有功能性血管狀系統的類腦器官（vascularized hCOs； vhCOs），為研究人類大腦發育與疾病提供了重要工具。

　　該研究中血管狀系統的建立基于ETS variant 2 （ETV2）引導的趨血管內皮細胞定向分化。ETV2是血管內皮細胞發育過程中的重要轉錄因子。研究組首先證明了在多種培養環境下（如擬胚體分化、神經分化及內皮細胞分化），ETV2的高表達均能有效地將人類胚胎干細胞誘導分化為內皮細胞。為研究ETV2的表達能否也在類腦器官中誘導內皮細胞分化、并進一步在類腦器官中形成血管結構，研究團隊將可誘導表達ETV2的胚胎干細胞按不同比例加入起始細胞群開展了類腦器官培養，并對ETV2誘導表達時間節點進行了測試。最終在經歷大量優化研究后具有血管狀結構的類腦器官得以被建立。

　　對于該系統的鑒定主要集中在兩個方面：1）類腦器官中的血管狀結構從組織形態和功能上有何特性？2）血管化類腦器官的發育與常規類腦器官相比有何異同？對于前一個問題，首先全組織免疫染色表明血管化類腦器官中形成了CD31陽性的內皮細胞管狀結構，且其隨著培養時間的延長而形成更為復雜的網絡 (圖1) 。更多的免疫染色（如CD31與CDH5）及基因表達檢測（如CD31、CDH5、TEK、KDR）進一步證明了類腦器官中的內皮細胞分化及血管結構的形成。

圖1 類腦器官全組織免疫染色

　　其次，類腦器官中的血管化結構能有效灌注異硫氰酸熒光素-葡聚糖（FITC-dextran）(圖2)，證明了該結構網絡的功能性。大腦中血管網絡的其中一個重要功能是形成血腦屏障，除血管內皮細胞外，研究組進一步通過對星形膠質細胞、周皮細胞、緊密連結（tight junction）蛋白（α-ZO1、Occludin等）的研究證實血管化類腦器官內能夠形成類似血腦屏障的結構，并通過跨內皮細胞電阻（trans-endothelial electrical resistance； TEER）及β淀粉樣蛋白（amyloid-β； Aβ）神經毒性模型證明了基于內皮細胞的緊密連結和血腦屏障特性。

圖2 類腦器官FITC灌注及免疫染色

　　此外，課題組將血管化類腦器官移植入小鼠并開展了核磁共振成像（magnetic resonance imaging； MRI）、FITC -dextran灌注及免疫染色等研究。與2018年Fred Gage課題組的報道一致【6】，移植入體內的對照類腦器官中能生成鼠源的血管結構。與之對比，人源的血管網絡僅能在移植的血管化類腦器官中生成并能被FITC-dextran有效灌注 (圖3) 。

圖3 類腦器官的移植與檢測

　　從類腦器官本身的發育角度來看，課題組通過對SOX2陽性的腦室區、CTIP2陽性深層神經元、SATB2陽性淺表層神經元等研究表明，血管化類腦器官和常規類腦器官總體上呈現類似的發育過程。其主要差異表現在經歷過長期的培養過程后（如120天），常規類腦器官內部因低氧等因素導致大量細胞死亡，而該現象在血管化類腦器官中得到顯著緩解。同時，全細胞膜片鉗等檢測表明血管化結構的存在能有效促進類腦器官中神經元的功能發育。單細胞轉錄組學的研究表明血管化類腦器官中內皮細胞群體大量表達血管生成相關基因（如FLT1, HAND1, MME, and VTN）及細胞粘附相關基因等；與人類大腦樣本比對分析表明，體外培養70天血管化類腦器官中的神經元接近16～19孕周的人腦樣本，而同樣時期對照類腦器官中的神經元更接近10～12孕周的人腦樣本，從而進一步證明血管化結構有利于類腦器官內的神經成熟。

　　總之，血管化類腦器官的建立為實現類腦器官的優化培養、促進其功能性成熟，以及為建立體外三維血腦屏障模型提供了新的方案，具有重要的生物學和醫學應用潛力。

　　原文鏈接：

　　https://www.nature.com/articles/s41592-019-0586-5

　　參考文獻

　　1. Lancaster, M.A. and Knoblich, J.A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science 345: 1247125 (2014)

　　2. Pa?ca, S.P. Assembling human brain organoids. Science 363:126-127 (2019).

　　3. Xiang, Y. et al. Fusion of regionally specified hPSC-Derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell 21:383-398.e7 (2017).

　　4. Xiang, Y. et al. Generation and fusion of human cortical and medial ganglionic eminence brain organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology 47. pii: e61. doi: 10.1002/cpsc.61 (2018).

　　5. Xiang, Y. et al. hESC-derived thalamic organoids form reciprocal projections when fused with cortical organoids. Cell Stem Cell. 24:487-497.e7 (2019).

　　6. Mansour, AA. et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol 36:432-441 (2018).