| 實驗步驟 | ##一、 cDNA 宏陣列的樣品制備
培養基： I : 2 (V7 V ) Gamborg B5 培 養 基（GibcoBRL， Rockville, MD), I : 1000(V /V ) Hyponex肥 料（Hyponex 10 : 5 : 10; Hyponex Japan, Osaka， Japan), 1 % 鹿糖 ； pH調 至 5. 7。
##二、 cDNA宏陣列探針制備（見注釋 1?4)
1.4 mol/L 硫 氫 酸 胍（guanidium thiocyanate) 溶 液 ： 4 mol/L 硫氧酸胍， 0 ?1mol/LTris-HCl, p H 7. 5， l0mmol/L E D TA , 0 . 5 % 十二焼基肌氨酸鈉， 0.1%β-疏 基 乙 醇
2.酸 -氯 仿（Phenol-chloroform): 50% (V. V ) 液態酚， pH 8.0， 4 8 % (VvV ) 氯仿， 2 % (V/V ) 異戊醇。
3.5.7 mol /L[氯化銫墊層： 5.7 mol/L氯化銫， 0.1mol/LEDTA,pH調至7.5。
4.DEPC 水 ： 0 . 1 % 焦碳酸二乙酯（DEPC)。
5.10X 雜交液： 1.2 mol/L NaCL 0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0， 50 mmol/L EDT A , 1 0 % 十二烷基磺酸鈉（SDS)。
6.BPB溶液： lOmmol/LTris-HCl， p H 7.5, 0.25% 溴酚藍， l mmol/L E D TA ，pH 8.0, 6 0 % (V/V) 甘油。
7.堿溶液： 0. 5 mol/L NaOH， I.5 mol/L NaCl。
8.中和液： I.5 mol/L NaCl， 0. 5 mol/L Tris-HCl; pH 調至 7. 4。
9.2XSSC: 300 mmol/LN aCl， 30 mmol./L 檸檬酸鈉。
##三、 cDNA宏陣列雜交
1.5 XM-MLV RT 緩沖液： 250 mmol/L Tris-HCl， pH 8.3, 375 mmol/L KC1，15 mmol/L MgC^ 0
2.不含 dCTP 的 dNTP 混合液： 20 mmol/L dATP， 20 mmol/L dTTP， 20 mmol/L dGTP。
3.雜 交 液（Church 磷酸緩沖液）： 0.5 mol/LNa<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,1mol/L EDTA，1μg/mL poly dA (Roche Diagnostics， Indianapolis， IN)， 7 % SDS， pH 調至 7. 2。
4.0.2 XSSC: 30 mmol/L NaCl， 3 mmol/L 梓樣酸鈉。
##四、方法
###1 cDNA宏陣列的樣品制備
（1）選 用 擬 南 芥 戶 sis Heyhn accession Columbia ( Col-O;
ABRC， Columbus， OH)。
（2）用來構建cDNA 文庫的植株在22°C下按照16 h 光 照 ： 8 h 避光的周期進行土壤培養。
（3）生長2?6 周的植株收集地上部分，包括花苞和綠色果莢。植株的水培養是把消毒后的種子散布入培養基，在 22°C下進行不間斷的光照和旋轉培養2 周。水培養的植株收集幼苗和根。
（4）為提取mRNA，先把植株在石棉塊上萌發，并 在 25°C , 5 0 % ?6 0 % 相對濕度，100 pmol HT2 s-1光量子通量密度（PPFD)， 14 h 光 照 ： 10 h 避光周期的條件下在葉箱中培養。
（5）用稀釋2000 倍 的 5 : 10 : 5 營 養 液（Hyponex， Hyponex Japan) 燒灌植株。兩周大的植株在臭氧葉室中進行200 nL.L O3處 理 12 h (7)。臭氧葉室保持25°C ，7 0 % 相對濕度， 100 (umol DT2sH PPFD的連續光照培養條件。環境空氣中培養的植株作為實驗的對照組。臭氧由臭氧發生器（Sumitomo Seika Chemical, Tokyo, Japan) 產生。
###2 cDNA宏陣列的探針制備（8）
####（1） Poly (A )+ R N A 的提 取
1.利用硫氫酸胍-氯化銫超速離心法提取地上部分、花苞、根部、 2?6 周大的植株和水培幼苗的總 RNA (9)。
2.取 ％ 冷凍組織，在液氮中研磨成粉，加 人 25 mL 4 mol/L 硫氫酸胍緩沖液。
3.勻漿于室溫， 5000 g 離 心 10 min。
4.將上清液轉移到新的離心管中并加入等體積酸- 氯仿，混勻。
5.5000 g 室溫離心5 min。
6.將上清液轉移到新的離心管中，重復步驟4 和 5 四次。
7.取上清，置 于 離 心 管 中 的 氯 化 銫 墊 層（15 m L , 5.7 mol/' L ) 之上， 20°C ，271 000 g?離心 22 h，離心機轉子為 RP50VF (Hitachi Koki， Tokyo, Japan)。
8.棄去離心管上清，并將離心管倒置于紙巾上吸去多余液體。
9.用 7 0 % 乙醇室溫下清洗沉淀，棄上清，吸去多余液體。
10.RN A沉淀晾干，用 DEPC 水溶解。
11.用 mRNA 純 化 試 劑 盒（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 將 Poly.(A )+ RNA從總R N A 中分離出來（見注釋5)。
####（2） c D N A 文 庫 的 構 建
1.取1. 5 ?7. 5 μg poly (A )<sup>+</sup> R N A 做模板，用 帶 有 一 個 Xho Ⅰ 位 點 的 oligo-(dT)<SUB>18</SUB>引物擴增，用 Superscript H (Invitrogen， Groningen, Netherlands) 反轉錄酶52°C 反 應 30 min合成第一鏈（見注釋6)。
2.第二鏈合成結束后，用 D N A 補 平 試 劑 盒（DNA Blunting Kit， TaKaRa Bio,Ohtsu， Japan) 將 cDNA末端補平，兩端各加一個EcoRI 接頭。
3.用 XAo I 消化后在cDNA 的 3 ? 切出XAo I 黏末端位點。
4.1 % 瓊脂糖電泳分離合成的 cDNA, 大小 在 1?3 k b 之間的片段用試劑盒(QIA-quick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Diisseldorf, Germany) 回收。
5.回收的片段通過E<sub>CO</sub>RⅠ-XhoⅠ位點連接到pBluescript Ⅱ載體上并電轉化到 E.coZz'XLl-Blue MRF』 菌 株（Stratagene) 中。
####(3) c D N A 文 庫 均 一 化
1.用S jtZg質粒DNA構建一個單鏈文庫。首先，用 20單位噬菌體 F l 的gene I I 內切 酶（M13 gpn protein; Life Technologies, Gaithersburg, MD) 37°C 處理 30min (見注釋7)，在質粒D N A 的 f l 復制起始點生成缺口。然后用250單位具有3'到 5'外切酶活性的外切酶m (NewEnglandBi0Iabs) 酶切得到單鏈質粒。整個反應在自帶緩沖液中完成（TaKaRa Bio, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 5mmol/L MgCl2, 10 mmol/L 2-巰基乙醇），力口水調整至總體積50 L ，在 37°C下孵育1h。
2.用 PCR 擴增得到的 cDNA插入片段，通過加入過量的cDNA插 人 片 段（大 約 1μg）使之發生自雜交。擴 增 cDNA插入片段時，用 約 5 n g 的 DNA模 板（由步驟 1 得到的單鏈文庫）與 I fiL 100 fxmol/L T7 引物 5'-TAATACGACTCACTATAGG0 3 』 和 1 卩 L 100 / imol/L SK 引物 5』-GCTCTAGAACTAGTGGATC-
3.混合，加人 Ex-TaqrDNA 聚 合 酶（TaKaRaBio) 在 Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler (Applied Biosystems， FosterCity, CA) 上進行 PCR 反應，反應程序如下： 7 min從室溫升到94°C ; 2 0 個循環，每循環94°C I min, 55°C 2 min,72°C 3 min。最后 72°C延伸 7 min。
3.PCR產物用乙醇沉淀，溶 解 于 1.5 水 ，然后與溶于5 juL甲酰胺的單鏈文庫 cDNA (50 ng)， 0 ?5 ( 1 0 鴻）5'端 封 閉 寡 核 苷 酸 混 合 物（^GCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCG^ 和 5，-AATTCGGCACGA0 3 ' ) 和 0.5 ( 1 0 噸）3、 封 閉 寡 核 苷 酸 混 合 物（5'-CTCGAGGGGGGGCCCGGTA-3』和 5』- GTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGT A T T A - 3 ，）混合。4?混合物置于80°C 3 min, 加 人 I IOX雜交緩沖液和I.5 fxL水 ，在 30°C反應
24 h。
5.剩余的質粒D N A單鏈環采用羥磷灰石色譜法純化后（1 0 ) 用 Klenow片段(TaKaRa Bio) 轉化成雙鏈DNA。然后將獲得的雙鏈D N A 電轉化到￡. 中。均一化的文庫一般有IXlO6 個獨立克隆。
####(4) 模 板 制 備 和 測 序
1.質粒DNA用堿裂解法在％ 孔板中提取（11)。
2.克隆用 A 扣1 1 和 Sma I 酶切，酶切產物進行瓊脂糖電泳，得到插人片段并確定片段長度。
3.BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) 對克隆進行核酸測序，在 D N A 自動測序儀（ABI PRISM 373和 377XL;Applied Biosystems) 上電泳。
4.從標準cDNA文庫中隨機挑選cDNA 克 隆（見注釋8)。在本例中，共 有 14 026個克隆由5'端測序， 39 207 個克隆由3'端測序。最終， 39 207個 3'表達序列標簽（EST) 被分成為 12 028 個獨立的組（8)。
5.12 028 個獨立的 E S T 克隆用來構建一個大規模的cDNA宏陣列。這 些 E S T 克隆用引 物 V-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'和 5'-TCATTAGGCA(^CCCAGGCTTTACAC-3』擴增。 PCR 反應在 Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler(Applied Biosystems) 上進行，反應體系為80 f/L 混合物，包 括 I jJL E.coZi細胞作為 PCR 模 板 ， I X Ex-T叫 緩 沖 液（TaKaRa Bio)， 2. 5 mmol/L MgCl2，0 ?2 mmoI/L dNTPs，上下游引物各 0. 2 Mmol/L 和 0 ?5 單位 Ex-Tag DNA 聚合
酶（TaKaRa Bio)。反應程序為35 個循環，每循環包括94°C解 鏈 45 s， 55°C 復性 45 s 和 72°C延 伸 2 min; 循環之后再72°C延 伸 4 min。
6.每個反應取4 斗 產 物 于 1. 5 % 的瓊脂糖膠上電泳檢測E ST片段的長度。
###3 大規模cDNA宏陣列的制備
1.剩余的 75 μLPCR 產物與 15 μL BPB 溶液混合后用 Biomek 2000 LaboratoryAutomation Workstation (Beckman Instruments Inc. , Fullerton, CA) 點在一張 8 Cm X12 cm 的 尼 龍 膜（Biodyne A ， Pall, East Hills, NY) 上。這臺儀器的點樣針可在膜上點出2880 個 E S T 克隆，因此，本 例 需 要 5 張不同的膜來容納
12 028個 EST克隆。圖 I A 為一張cDNA宏陣列的示例。
2.XDNA (10 mg/> μL) 點在膜上作為陰性對照。
3.點好的膜先置于裝有堿溶液的淺盤中變性2 mm，再轉移到中和液中反應2 min。
4.將膜用2 XSSC清洗后，有 D N A的一面向上放在紙巾上晾干。
5.膜晾干后，通過紫外交聯（1.2 J/cm<sup>2</sup>) 將點上的 E ST克隆固定在膜上。
###4 cDNA宏陣列的雜交
####（1） 同 位 素 標 記（R N A S E )
1.目標樣本的總R N A 或 m R N A 如 2 所述制備。在本例中，總 R N A 來自臭氧處理和未處理的擬南芥植株。
2.10 μg 總 R N A [或 0.2 μg poly A<sup>(+)</sup>+ R N A ] 與 2 μg Oligo-dT<sub>(12-18)</sub> (Invitrogen)
混合，加 DEPC 水調整總體積至14μL。
3.將該RNA溶 液 70°C 孵 育 10 min，冰 浴 2 min。
4.加人 6 μL5XM-M L V R T 緩沖液， 1.5 μL 不 含 d N T P 的 d N T P 混合液， 1μL 0.1 m o l/L D T T ， 6 μL [α<SUP>-33</SUP>P] dCTP (spec act > 2 5 0 0 Ci/m m ol; Amersham Biosciences) 和 7. 5 單位 SuperScript II (Invitrogen) 。
5.混勻后將反應混合物 37°C孵 育 90 min。冰浴 5 min。
6.將樣品置于 G——50 離 心 柱（Probe Quant 0 5 0 Micro Column; Am ersham Bioscie n c e ) 中 ， 820 g■離心 2 m in。
7.收集濾液（約 30 μL) 并 于 95°C 變性,5 min。
8.將變性后的探針置于冰上直至使用。
####（2） 雜交
1.將 cDNA宏陣列膜置于雜交袋（Atto, Tokyo, Japan) 中。
2.將 IOm L 雜交液倒入袋中，用加熱封口機封袋。
3.雜交袋沒人 65°C 水浴中 1?2 h。
4.將雜交袋從水浴中取出，用剪刀剪去一角。
5.將變性后的探針（3.2.1) 加入雜交液中，將袋中的空氣盡可能擠凈。
6.將雜交袋重新封好。
7.雜交袋沒人65°C水浴中不少于 16 h。
8.雜交結束后，用剪刀剪去雜交袋一角，打開袋子。
9.將膜轉移到一裝有 250 mL 0. 2X SSC， 0.1% SDS 的平底塑料盒中。
10.65°C 輕輕晃動 15 min 洗 膜（見注釋10)。
11.將溶液換成新的 250 mL 0. 2 XSSC， 0. 1 % SDS, 把盒子轉移到 65°C 水浴中，輕輕搖晃 15 min。
12.將膜置于紙巾上吸去大部分液體。
13.用塑料包裹膜后置于成像盤（Fuji Film, Tokyo, Japan) 中不少于 12 h。
###5 數據收集和統計分析
1.用 50 p m 分辨率的高分辨率掃描儀（ Storm; A m ersh a m B io scien ces) 掃描放射自顯影片，然后用A rrayV ision 軟 件（A m ersh a m B io scin ces) 對信號強度定量。圖 IB 為一張掃描的例圖。
2.將信號強度數據以「.csv」格式導出，導入數據分析軟件^ ^ MicrosoftExcel Version X， Microsoft, Redmond, WA) 進行分析。
3.用全局均一化法（見 注 釋 1 1 ) 將膜與膜之間的數據差異均一化，具體做法為：將膜上所有信號的強度求平均值，用目標信號強度與膜的平均強度比值求得相對信號強度。這樣，這個評估值就稱之為表達率。
4.在進一步分析之前，計算重復點的表達率平均值。在篩選刺激應答基因（本例中為臭氧應答基因）時，首先去除表達率在背景信號（陰性對照 X D N A 的平均表達率）10倍以下的基因；這個表達水平相當于 0.02% 的總RNA。在本例中，這個過程排除了 12 028個 E S T 中的大約 2/3。
5.選擇經處理后（ 本例中為臭氧處理，見 圖 2 ) 表達量提升或下調 3 倍以上的基因做進一步分析。
6.采用單因素方差分析（顯著性水平<〇. 〇 5) 鑒別出結果可重復的，對刺激產生應答的基因。這一步要用到 F 統計，即在兩個或多個隨機樣本信息的基礎上評估群體的變異，從而檢驗不同實驗條件下 mR N A 表達水平差異的統計學顯著性。在本例中，找到了 205個被臭氧調控的不冗余的 EST，其 中 157個表達被臭氧誘導， 48個表達被抑制（圖 3) (12)。
7.(可選）如果有必要進行系統聚類（1 3 ) 和 K-均值聚類分析，推薦用 GeneSpring 軟 件 包（version 5.0， Silicon Genetics， Redwood, CA)。
8.對擬南介數據的處理，可 以 在 Research and Tools (DART) 程序的數 據 庫（http://tabacunxagr.nagoya-u.ac.jp/dart. ) 中搜索基因名和注釋。基因的功目旨分類可以先通過 MATDB (http:/,mips.gsf.de/proj/thal/db/index?html) 對 E S T 分類。然后未分類的E S T 再通過注釋所述中推測的功能再次分類。
###6 cDNA 子陣列的制備
當對刺激產生應答的基因被篩選出來后，制備一個篩選基因的子陣列就非常有利于進一步分析。因為一般情況下，只有約 1 0 % 的基因對目標刺激發生響應，而在進一步的實驗中一個子陣列比大規模宏陣列要方便得多。子陣列一般包括 1〇〇 ?1000個基因，但是我們曾經做過一個只有 12 個基因的子陣列（14)。子陣列的用處非常多。例如，由于傳統用來驗證基因表達的 Northern 印跡和定量 PCR 都比較費時費力，就可以用子陣列來驗證篩選出來的基因是否能正確地響應目標刺激。而且子陣列還可以用來比較突變株和不同組織間與刺激相關的基因表達差異（11)。
1.目標 cDNA克隆可以從公共資源庫中或自己克隆得到。在本例中，擬 南 芥 157個臭氧誘導的EST 來自于 Kazusa DNA 研 究 所（Kisarazu， Japan)。
2.用 3. 2. 3 所述擴增條件及引物 5'-GTTTCCCAGTCACGAC-3'和 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'(這對引物對應于由 pBR 衍生的質粒載體）對這些 E S T 克隆的插入片段進行 PCR擴增。
3.將 75 pL 上述 PCR 產物與 15 BPB 溶液混合，用 Multi Pin Blotter 96 (Atto)點樣于 9 cmX 12 cm 的尼龍膜（Biodyne A ， Pall) 上 ，每個樣本兩兩重復。圖 3為一子陣列的示例。
4.XDNA (10 mg/fxL) 點在膜上作為陰性對照。
5.如 3. 3 所述將 cDNA 點固定在膜上。
6.如 3. 4 所述雜交并對信號強度進行定量。
7.用重復點的平均信號強度減去陰性對照（XDNA) 的平均信號強度得到每個點的信號強度。
8.選取刺激處理后表達水平未發生改變的基因的信號強度作為參照標準，對每個基因的信號強度進行均一化。在本例中，選擇 AiTwM 作為均一化的標志物，因為 AtTwW 已經被證實在應激條件下表達不發生改變（5）。 |
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