10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和 cDNA分開。
11. 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機上以最大速度4℃離心15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監測儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來。
12. 用 70%乙醇洗滌沉淀物，重復離心。
13. 小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。
14. 如果需要用EcoR I甲基化酶對cDNA進行甲基化，可將cDNA溶解于80μl
TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not I或Sal I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將 cDNA懸浮在29μl
TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進行cDNA合成的下一步驟。
[階段 3：cDNA的甲基化]
1.在cDNA樣品中加入以下試劑：
2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl
5 mol/L NaCl 2μl
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl
加H2O至 96μl
2.取出兩小份樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號和 2號，置于冰上。
3.在余下的反應混合液中加入2μl EcoR I 甲基化酶（80 000單位/ml），保存在0℃直至步驟4完成。
4. 再從大體積的反應液中吸出另外兩小分樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為3號和4號。
5.在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟 4）加入100 ng質粒DNA或500 ng的λ噬菌體DNA。這些未甲基化的DNA在預實驗中用作底物以測定甲基化效率。
6.所有四份小樣實驗反應和大體積的反應均在37℃溫育1h。
7.于68℃加熱15min，用酚：氯仿抽提大體積反應液一次，再用氯仿抽提一次。
8. 在大體積反應液中加入0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混勻后貯存于-20℃直至獲得小樣反應結果。
9.按下述方法分析4個小樣對照反應：
a. 在每一對照反應中分別加入：
0.1 mol/L MgCl2 2μl
10×EcoR I 緩沖液 2μl
加H2O至 20μl
b. 在2號和4號反應管中分別加入20單位EcoR I。
c. 四個對照樣品于37℃溫育1h，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
10. 微量離心機以最大速度離心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。棄上清，加入200μl 70%乙醇洗滌沉淀，重復離心。
11. 用手提式微型探測器檢查是否所有放射性物質均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將DNA溶于29μl TE（pH8.0）。
12. 盡可能快地進行cDNA合成的下一階段。
[階段4：接頭或銜接子的連接]
cDNA末端的削平
1.cDNA樣品于68℃加熱5 min。
2.將 cDNA溶液冷卻至37℃并加入下列試劑：
5×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 10μl
dNTP溶液，每種 5 mmol/L 5μl
加H2O至 50μl
3.加入1~2單位T4噬菌體DNA聚合酶（500單位 /ml），37℃溫育15min。
4.加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以終止反應。
5.用酚：氯仿抽提，再通過Sephadex G-50離心柱層析，除去未摻入的dNTP。
6.在柱流出液中加入0.1倍體積的3 mol/L 乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇，樣品于4℃至少放置15 min。
7.在微量離心機上以最大速度離心15 min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀經空氣干燥后溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).