cDNA文庫的構建3

接頭-銜接子與cDNA的連接
8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：
10×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 2μl
800~1000 ng 的磷酸化接頭或銜接子 2μl
T4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml） 1μl
10 mmol/L ATP 2μl
混勻后，在16℃溫育8~12h。
9.從反應液中吸出0.5μl貯存于4℃，其余反應液于68℃加熱15min以滅活連接酶。

[階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA]
Sepharose CL-4B柱的制備
1.用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進1ml滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。
2. 將一段無菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內充滿緩沖液，用止血鉗關閉軟管。
3.在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數分鐘，放開止血鉗，當緩沖液從吸管滴落時，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B，直至填充基質幾乎充滿吸管為止。
4.將幾倍柱床體積的含0.1 mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關閉柱子底部的軟管。
依據大小分離回收DNA
5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50μl或更小），放開止血鉗，使cDNA進入凝膠。用 50μl TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充滿泡沫管。
6. 用手提式小型探測器監測cDNA流經柱子的進程。放射性cDNA流到柱長2/3時，開始用微量離心管收集，每管2滴，直至將所有放射性洗脫出柱為止。
7. 用切侖科夫計數器測量每管的放射性活性。
8.從每一管中取出一小份，以末端標記的已知大小（0.2kb~5kb）的DNA片斷作標準參照物，通過1%瓊脂凝膠電泳進行分析，將各管余下部分貯存于-20℃，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。
9.電泳后將凝膠移至一張 Whatman 3MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干燥器上干燥。干燥過程前20min至30min于50℃加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態繼續干燥1~2h.
10. 置-70℃加增感屏對干燥的凝膠繼續X射線曝光。
11. 在cDNA長度≥500bp的收集管中，加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量離心機于4℃以 12 000g離心15min，以回收沉淀的cDNA。
12. 將DNA溶于總體積為20μl的10 mmol/L Tris- HCl(pH7.6)中。
13. 測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于λ噬菌體臂相連接的DNA總量。
[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到第二鏈的活度值(cpm)]*2xμg cDNA第二鏈合成量=可用于連接的cDNA [階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接]
1.按下述方法建立4組連接-包裝反應：

連接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA儲存于-20℃。
2.按包裝提取物廠商提供的方法，從每組連接反應物中取5μl包裝到噬菌體顆粒中。
3.包裝反應完成后，在各反應混合物中加入0.5ml SM培養基。
4.預備適當的大腸桿菌株新鮮過夜培養物，包裝混合物做 100倍稀釋，各取10μl和100μl涂板，于37℃或42℃培養8~12小時。
5.計算重組噬菌斑和非重組噬菌斑，連接反應A不應產生重組噬菌斑，而連接反應B、C和D應產生數目遞增的重組噬菌斑。
6.根據重組噬菌斑的數目，計算cDNA的克隆效率。 7.挑取12個重組λ噬菌體空斑，小規模培養裂解物并制備DNA，以供適當的限制性內切核酸酶消化。
8.通過1%瓊脂凝膠電泳分析cDNA插入物的大小，用長度范圍500bp~5kb的DNA片段作為分子質量參照