1．pBlueScriptII的提取
1．取1ul商品的pBlueScriptII，轉化入大腸桿菌宿主菌中，取5ul轉化產物均勻涂布在含AMP的LB平板上，37℃培養過夜。
2．第二天取一只無菌的50ml離心管，加入10ml AMP抗性的LB液體培養基，挑單克隆于離心管中，37℃，250rpm，培養過夜。
3．第三天取200μl小搖后的菌液接種于250ml 含AMP的LB液體培養基中，37℃，250rpm培養6 hr左右，使OD值達到0.6-0.8。
4．將菌液移入250ml離心管中， 4℃，3000rpm，離心15min。取出離心管，菌團朝上倒掉上清，將離心管倒置于吸水紙上使上清充分濾干。（注意離心前需配平）
5．加入10ml溶液Ⅰ（50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8．0），加入RNase至終濃度100μg/ml，晃動搖菌，使菌體充分懸浮，靜置10min。
6．按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鮮配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，靜置3-5min。
注： 靜置時間勿超過5min，提前將溶液Ⅲ置于冰盒中。
7．加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。
8．4℃，5000rpm，離心15min。
9．取上清于兩個50ml離心管中，棄去原離心管中的沉淀。
10．每管加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫下放置10min。
11. 20℃，12000g，離心20min回收質粒沉淀。
12．棄上清，用70％的乙醇洗2次。
13．棄上清，倒扣于吸水紙上，盡量空干液體。
14．用3ml TE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5ml Eppendorf離心管中。
15．電泳檢查DNA質量并定量。（必要的話，可以用膠回收的方法先純化一下質粒再進行雙酶切。）
2．pBlueScriptII的雙酶切消化
1．以如下體系進行EcoRI酶切：
pBSK(+) X μl（6μg）
ddH2O 174-X μl
10×Buffer E 20 μl
混勻，加入限制性內切酶：
EcoRI （10U/ μl） 6 μl
總體積為200 μl。
2．輕彈管壁或用槍頭輕輕吹打混勻，在離心機上甩一下。
3．37℃，水浴1hr。
4．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混勻。4℃，13000rpm，離心15min。
5．取上清，加入等體積的氯仿，4℃，13000rpm，離心10min。
6．取上清，加入0.1倍體積的NaAC和2.5倍體積的無水乙醇，－20℃，沉淀30min。
7. 4℃，13000rpm，離心10min，棄上清，取沉淀。
8．加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。
9．4℃，13000rpm，離心10min，棄上清，取沉淀。
10．自然風干沉淀，至無乙醇味，加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。
11．加入以下試劑進行XhoI酶切：
ddH2O 74 μl
10×Buffer D 20 μl
混勻，加入限制性內切酶XhoI：
XhoI （10U/ μl） 6 μl
總體積為200 μl。
12.輕彈管壁或用槍頭輕輕吹打混勻，在離心機上甩一下
13.37℃，水浴1.5hr。
14．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混勻。
15．4℃，13000rpm，離心15min。
16．取上清，加入等體積的氯仿，4℃，13000rpm，離心10min。
17．取上清，加入0.1倍體積的NaAC和2.5倍體積的無水乙醇，－20℃，沉淀30min。
18. 4℃，13000rpm，離心10min，棄上清，取沉淀。
19．加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。
20．4℃，13000rpm，離心10min，棄上清，取沉淀。
21．自然風干沉淀至無乙醇味，加入40ulddH2O充分溶解沉淀，得到雙酶切載體。
3．載體去磷酸化
1．在40ul雙酶切載體中加入以下試劑：
6ul 10×buffer
6ul CIAP（0.01U/ul）
8ul ddH2O
總體積60ul。
2.輕彈管壁或用槍頭輕輕吹打混勻，在離心機上甩一下。
3.37℃，水浴1hr。
4．70℃，15min，滅活酶。
5．電泳分離，膠回收雙酶切載體，定量。
4．載體效率檢測
1．按以下所示作4個連接反應：
DNA | 連接酶 | ||
1 | pBlueScriptII/E/X /CIAP | - | 檢測酶切效率 |
2 | pBlueScriptII/E/X /CIAP | + | 檢測脫磷效率，載體自連效率 |
3 | 商品Vector加標準Insert | + | 對照 |
4 | 自制Vector加標準Insert | + | 檢測載體效率 |
14℃連接過夜。