二.mRNA的分離
1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法
準備工作：
1.將Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋轉混勻，溶解 Oligotex.,然后置于室溫。
2.將OBB Buffer置于37℃水浴中，旋轉混勻，重溶沉淀物，然后置于室溫。
3.將 OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。
試驗步驟：
表3：加入試劑量據此表
Total RNA | RNase-free Water to: | Buffer OBB(ul) | Oligotex | Prep size |
<=0.25mg | 250ul | 250ul | 15 | Mini |
0.25-0.5mg | 500ul | 500ul | 30 | Midi |
0.5-0.75mg | 500ul | 500ul | 45 | Midi |
0.75-1.00mg | 500ul | 500ul | 55 | Midi |
1.TotalRNA量不要多于1mg ，用移液器取出所需RNA量到1.5ml離心管中，加RNase-freewater補足到500ul
2. 根據表3加入適當體積的OBBBuffer和OligotexSuspension，輕彈1.5ml離心管徹底混勻
3.置于70℃水浴中 3min
4.取出置于室溫（20℃－30℃）10min
5.13000rpm室溫離心2min，用移液器吸出上清到一個新的1.5ml離心管中，保留上清直到polyA被結合上。
6.用移液器取400ulOW2Buffer混勻沉淀物，將混合物轉移到SpinColumn 中，RT，13000rpm，離心1min
7.將SpinColumn轉移到一個新的1.5ml離心管中，加 400ulOW2，RT，13000rpm，離心1min
8.將SpinColumn轉移到一個新的1.5ml管中，取出 25ulOERBuffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次樹脂，室溫13000rpm，離心1min。
9.取出 25ulOERBuffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次樹脂，室溫13000rpm，離心1min。
10.測OD,并電泳定量。
2.磁珠法分離mRNA
1.在RNase-free的Eppendorf管中加入0.1~1.0mg 的總RNA和RNase-free水至終體積為500ul.
2.65oC加熱10分鐘。
3.加入3ul生物素標記的 Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，輕輕混合，室溫放置逐漸冷去至室溫，一般需10分鐘左右。
4.同時配 0.5×SSC1.2ml和0.1×SSC1.4ml.
5.將磁珠（SA-PMPs）輕晃散開，放入磁性分離架上，使SA-PMPs集中于管的一側（約30sec），小心去上清，切不可離心。用0.3ml0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分離架集中磁珠，去除上清，重復3次。
6. 將漂洗后的SA-PMPs重新懸浮于0.1ml0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs應在30分鐘內使用。
7.將（3）中的 oligo(dT)/mRNA退火反應物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，輕輕搖勻，室溫下放10分鐘。
8.用磁性分離架捕獲SA- PMPs,小心去上清，但不要棄去。
9.用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs懸浮，最后一次漂洗后盡可能多的吸取水相，而不損壞SA-PMPs.
10.將SA-PMPs重新懸浮在0.1mlRNase-free水中，反復顛倒，使SA-PMPs散開，洗脫mRNA。
11.用磁性分離架捕獲SA-PMPs,將洗脫的mRNA吸入另一個新的Eppendorf管中。
12.將SA- PMPs再懸浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脫，與（11）步洗脫液合并。
13.將得到的mRNA溶液取幾微升跑電泳，若 mRNA濃度不足以進行下一步的反轉錄，則需將得到的mRNA溶液濃縮（濃縮步驟見14-18）。
14.加0.1體積的3mol/lNaAc和 1.0體積的異丙醇于洗脫液中，-20oC沉淀過夜。
15.4oC，13000g離心60分鐘。去上清，加入500ul70%乙醇混勻。
16.4oC，7500g 離心10分鐘。
17.去上清，真空或空氣中自然風干，但不要太干，加適量RNase-free水溶解。
18.重復步驟5-12，將步驟8保留下的樣品重新上柱
注意事項：
1．所有操作均需要嚴格戴手套，戴口罩進行
2．如果totalRNA質量高，雜質少，就選擇Oligotex的方法分離mRNA，相反則可以用磁珠法。
3．mRNA的電泳圖是smear.