三．cDNA雙鏈合成
1.SupersciptII —RT合成第一鏈:
1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入
xul mRNA(大約500ng)
1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul)
(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-xulRNase-freewater
（大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一鏈,第一鏈合成完畢后將n管合成一管進行第二鏈合成.）
2.混勻后,70℃反應10分鐘;
3.反應完成后,立刻將反應體系置于冰上5min;
4.稍微離心一下,順序加入以下試劑:
4ul 5×firststrandbuffer
2ul 0.1MDTT
1ul 10mMdNTP(自己配制)
5. 混勻，稍微離心反應物之后,42℃放置2分鐘;
6.反應完成,趁熱加入1ulSupersciptII—RT,混勻;
7.42℃反應 50分鐘,然后70℃,15分鐘滅活反轉錄酶.
2.cDNA第二鏈的合成:
1.第一鏈反應完成后,取2ul一鏈產物－20℃冰箱中保存，待電泳檢測。其余的產物合并，混勻，然后順序加入下列試劑(promega):
20ul 10×DNAPolymeraseIbuffer
6ul 10mMdNTP(自己配制)
xul ddH2O
1ul RNaseH(2U/ul)
10ul DNAPolymeraseI(10U/ul)
總體系為200ul;
2.混勻后,16℃反應2.5小時;
3.70℃滅活10分鐘;
4.反應完成后,得到200ulcDNA第二鏈反應體系,將此體系置于冰上;
5．取2ul二鏈產物，同保存的一鏈產物一起電泳鑒定。同時上1kbladder，確定雙鏈的大小范圍。
注：一鏈，二鏈的電泳圖是smear，且二鏈稍比一鏈大一些。
3.雙鏈cDNA末端補平:
1.在第二鏈反應體系中,順序加入下列試劑(promega):
6ul 10mMdNTP
2ul T4DNAPolymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2.稍微離心混勻反應物,37℃反應至少30 分鐘,然后75℃滅活10分鐘;
3.加入等體積酚/氯仿/異戊醇,劇烈振蕩后,常溫下13000g離心5分鐘;
4.離心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等體積氯仿,上下顛倒幾次混勻后,常溫下13000g離心5分鐘;
5.吸取上清至另一 eppendof管,加入1/10V3MNaAc(PH5.2)和2.5V預冷的無水乙醇,混勻,-20℃放置過夜以沉淀雙鏈cDNA;
6.第二日,將昨日沉淀物在4℃,13000g離心60分鐘以充分沉淀雙鏈cDNA;
7.離心完畢,棄上清,加入1ml70%乙醇洗滌沉淀,常溫下 13000g離心5分鐘;
8.離心完畢,棄上清,干燥沉淀至無乙醇氣味.
注：第3，第4步可以用PCR純化試劑盒代替。
PCR 純化試劑盒操作流程：
1．溶液PE使用前應加入適量體積95％－100％的乙醇，混勻。
2．向200ul二鏈補平產物中加入5倍體積的bufferPB，混勻。
3．加入spincolumn中，13000rpm離心1min。
4．加入 0.75mlbufferPE，13000rpm離心1min。
5．13000rpm，再離心1min。
6．將spincolumn 放入一新的離心管中，加入50ulbufferEB，靜置10min。
7．13000rpm離心2min。
8．加入 30ulbufferEB，靜置10min。
9．13000rpm離心2min。
10．加入1/10體積3M的NaAc，2.5倍體積無水乙醇，混勻，－20℃沉淀過夜。