4EcoRIadaptor加接:
1.往雙鏈 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀;
2.溶解完成后,順序加入下列試劑:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mMrATP
1ul T4DNA Ligase(4U/ul)
3.混勻后,4℃連接3days,或者8℃過夜連接;
5雙鏈cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切:
1.連接反應完成后,將反應體系70℃放置15分鐘滅活 T4DNALigase;
2.稍微離心使反應物集中至管底,室溫下放置5分鐘,然后加入下列試劑:
1ul 10×LigaseBuffer
1ul 10mMrATP
6ul ddH2O
1ul T4PNK(10U/ul)
3.37℃反應30分鐘,然后70℃滅活15分鐘;
4.稍微離心使反應物集中至管底;
5.室溫放置5分鐘;然后加入下列試劑:
4ul Xho10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul XhoI(10U/ul)
6.37℃反應1.5小時,然后65℃滅活酶10分鐘;
7.反應完成,雙鏈cDNA合成完畢。置于4℃準備回收。
6.膠回收cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit回收試劑盒)
1．配制小膠數板（每個樣品一板）：1%瓊脂糖凝膠，2ulEB/300ml膠
2．取4℃保存樣品上樣，40ul/孔。
3．電泳50V；1hr
4．紫外燈下分別切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.，分別放入已做標記的 1.5ml離心管中。
5．稱取膠重，加入三倍體積bufferQXI（例如，100mg膠中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴數分鐘，至膠完全融化。用手指彈QIAEXII使重懸，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃水浴10min，每隔2min取出顛倒混勻數次，使QIAEXII保持懸浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（棄上清，離心機中甩一下，吸取上清）
9．加入 500ul bufferQXI，輕彈管底使QIAEXII重懸
10．離心并去上清（同操作8）
11．加入500ul bufferPE，重懸QIAEXII，離心30sec，去上清
12．再加入500ul bufferPE，重懸QIAEXII，離心30sec，棄上清，離心機中甩一下，吸去上清
13．超凈臺上吹干（至無乙醇味），加入10ul elution buffer，重懸QIAEXII，靜置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14．取1ul上清上樣電泳，同時做分子量標準（1kb ladder）及DNA含量標準（10ng，20ng）作對照。
15．將收回的cDNA置于-20℃內保存，據電泳結果，取適量DNA進行連接。
注意事項：
1．膠回收前電泳槽，電泳板，梳子等都要用1％的HCl浸泡過夜。
2．膠回收時電壓要穩定。
四．載體制備
1．pBlueScriptII 的提取
1．取1ul商品的pBlueScriptII，轉化入大腸桿菌宿主菌中，取5ul轉化產物均勻涂布在含AMP的LB 平板上，37℃培養過夜。
2．第二天取一只無菌的50ml離心管，加入10ml AMP抗性的LB液體培養基，挑單克隆于離心管中，37℃，250rpm，培養過夜。
3．第三天取200μl小搖后的菌液接種于250ml 含AMP的LB液體培養基中，37℃，250rpm培養6 hr左右，使OD值達到0.6-0.8。
4．將菌液移入250ml離心管中， 4℃，3000rpm，離心 15min。取出離心管，菌團朝上倒掉上清，將離心管倒置于吸水紙上使上清充分濾干。（注意離心前需配平）
5．加入10ml溶液Ⅰ （50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8．0），加入RNase至終濃度100μg/ml，晃動搖菌，使菌體充分懸浮，靜置10min。
6．按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鮮配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，靜置 3-5min。
注： 靜置時間勿超過5min，提前將溶液Ⅲ置于冰盒中。
7．加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。
8．4℃，5000rpm，離心15min。
9．取上清于兩個50ml離心管中，棄去原離心管中的沉淀。
10．每管加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫下放置10min。
11. 20℃，12000g，離心20min回收質粒沉淀。
12．棄上清，用70％的乙醇洗2次。
13．棄上清，倒扣于吸水紙上，盡量空干液體。
14．用3ml TE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5ml Eppendorf離心管中。
15．電泳檢查DNA質量并定量。（必要的話，可以用膠回收的方法先純化一下質粒再進行雙酶切