cDNA的篩選1

（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板
宿主細菌制備
1.用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。
2.將過夜培養物以3000×g離心5min。
3.分別用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol /L MgSO4; 高壓滅菌）重懸細胞沉淀。
4.細胞懸液可用于4℃貯存至一周。

預制噬菌體懸液鋪平板
以已知滴度（如，已知每ml噬菌體顆粒數）的cDNA文庫或其他噬菌體懸液開始，用λ－dil稀釋以達到所需每平板噬菌體數。每個90mm直徑平皿5×103個噬菌體/100μl開始篩選。

鋪平板
1.將所需數量的LB平板置 42℃溫箱預熱。
2.LB頂層瓊脂（每平板最少2.5ml）用微波爐熔化，然后置49℃水浴中。
3.為溫箱內的每一個平板準備一個 12ml帶螺旋蓋試管，于室溫，放在合適的架子上。
4.用移液器每管加100μlλ－dil稀釋的宿主細胞懸液。
5.每管加 100μl稀釋的噬菌體懸液與細菌于漩渦器上簡短混合。
6.含細菌和噬菌體（感染混合物）的試管于37℃溫育25min，然后室溫放置。
7. 用一支消毒的10ml 玻璃移液管在本生燈火焰上稍稍預熱，取2.5ml保存在49℃的熔化頂層瓊脂加到一支含感染混合物的試管內。
8.立即在手掌之間滾動混合管內混合物，然后均勻地倒入一個預熱的LB平板上。
9.倒好的平板于室溫置水平面上直至頂層瓊脂凝固（至少5min）。
10. 重復步驟7至9，直至所有的細菌和噬菌體混合物都鋪平板。
11. 平板置42℃溫箱（對λgt11）直至噬菌斑長出。

（二）雜交篩選——cDNA序列作為探針

4. 膜剝離：首先，用軟鉛筆在干的硝酸纖維素濾膜上給準備影印的平板編號。其次，從平板的中央開始向邊緣小心將濾膜鋪在菌臺上。當濾膜完全變濕后（顏色變灰），再等30s。同時，用針頭在平板上標出濾膜的3個不對稱位置。小心將濾膜從平板上剝離，接觸面向上放在一張干凈的Whatman 3MM濾紙上。在進行下一步驟之前，所有的平板重復步驟4。
5.將濾膜接觸面向上漂浮在變性液（0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol /L NaCl）中5min。
6.中和5min。
7.用2×SSC洗滌5min。
8.將濾膜放在一張新的 Whatman 3MM濾紙上，用鉛箔將濾膜和濾紙一起包住。
9.在真空爐中80℃烘烤2h。
10. 用6×SSC預先短暫地濕潤濾膜，然后用預洗液（50 mmol/L Tris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1% SDS）于 68℃預洗滌至少1h。用一個盤子放在水浴搖床上。
11. 將25張濾膜轉移到一個裝有 50ml雜交液（5×SSPE；1×Denhardt’s液；100μg/ml cT-DNA；0.1％SDS）的貯存罐內（直徑至少90mm），68℃ 預雜交2h。
12. 對于每ml雜交液，2倍的105至1×106cpm的雙鏈探針經沸水浴變性10min后，迅速放冰上冷卻。
13. 變性探針立即加到預雜交混合液中。
14. 在封口的貯存罐內于68℃雜交過夜，不斷地晃動以防濾膜粘在一起。
15. 雜交結束后，濾膜用2×SSC，0.01％SDS于室溫洗滌3次約1h。
16. 將潮濕（防止干燥）的硝酸纖維素濾膜放在一張硬紙或X光片上，用放射性墨水在針頭標簽上作標記。
17. 濾膜用塑料包裝袋（如Saran）包住，然后加上增感屏在X光片上于－70℃曝光過夜。