| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | 保存于細菌中的克隆純的、已測序確證的人 EST 序列 |
| 試劑、試劑盒 | LB 培養基 超級肉湯培養基 乙醇 裂解液 RNA 酶溶液 緩沖液 乙醇 乙酸溶液 丁二酸酐 1－甲基－2－吡咯烷酮 硼酸鈉 |
| 儀器、耗材 | 離心機 96 孔熱循環儀 水浴鍋 微量滴定板清洗儀 |
| 實驗步驟 |
實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」 1. 將密閉的克隆純的、已測序確證的人 EST 母板在 37℃ 培養過夜。 2. 取多套標準圓底 96 孔板，全部做好標記，每孔加入 100 ul 添加了 100 ug/ul 羧芐青霉素的 LB 培養基準備復制。 為保存母板，第一次復制母板時應該多重復幾套平板作為工作平板。應該核對這些 EST 克隆是裝在青霉素抗性的載體里，一般入 IMAGE 克隆都是這樣的。 3. 打開前將母板在 20～25℃ 下以 167 g 輕微離心 2 min （在水平培養板轉子上是 1000 r/min）， 以除去蓋子上凝聚的水汽或液滴。 4. 用 100％ 乙醇把容器裝滿一半，將 96 針多點復制器浸入再取出，然后點燃復制器上的針。 5. 待復制器冷卻后，將它伸進母板，然后取出伸進對應的 LB 子代培養板。如有必要，可多重復接種幾板。 6. 將接種后的子代 LB 培養板蓋好蓋子，放進裝有濕紙巾的 1 gal 可密封儲存袋中 37℃ 培養過夜。 7. 向 96 孔深孔板每孔加入 1 ml 含有 100 ug/ul 羧芐青霉素的超級肉湯培養基。 8. 用 96 點復制器從新鮮培養的 LB96 孔板接種到深孔板。 9. 用多微孔膠帶封住深孔板的口，再蓋上塑料蓋。將培養板放到水平搖床上，37℃，200 r/min 培養 24 h。 10. 往即將凍存于 -80℃ 作為接種源的工作平板上每孔加入 45 ul 45％ 的滅菌甘油。 11. 把裂解緩沖液（裂解小抽試劑盒）在 37℃ 加熱至 SDS 溶解。 12. 往 100 ml 重懸緩沖液（裂解小抽試劑盒）里加入 1 ml RNA 酶，并存放在 4℃。 13. 準備好 96 孔收集板（裂解小抽試劑盒），往每孔加入 350 ul 100％ 的變性乙醇。把過濾板放在收集板上面并用膠帶固定。 14. 在配有 96 孔板水平轉子的離心機上，于 20～25℃ 以 1500 g 將深孔板細菌培養液離心 7 min。 15. 輕輕倒掉上清，并將剩余培養基倒在干凈的紙巾上。 16. 用 100 ul 重懸緩沖液重懸沉淀。渦旋儀振蕩直到所有沉淀徹底重懸。 17. 加入 100 ul 裂解緩沖液。從側面晃動培養板輕輕混勻；避免剪切力弄斷細菌染色體 DNA。 18. 每孔加入 100 ml 沉淀緩沖液，快速混勻后加入 100 ul 中和緩沖液，渦旋儀振蕩。 19. 用試劑盒附帶的寬口槍頭將深孔板內容物轉移到先前準備好的過濾板/收集板疊堆。 20. 將疊堆板在 20～25℃，1500 g 離心 12 min。 21. 將它們從離心機上取下，拋去過濾板。將收集板中的乙醇和濾過液倒掉，用干凈的紙巾輕輕吸掉剩余的乙醇。 22. 每孔加入 500 ul 70％ 乙醇，立即倒掉。用干凈的紙巾輕輕吸掉剩余的乙醇。 23. 將收集板放入干凈的抽屜，不蓋蓋子，只覆蓋一層干凈的紙巾，放過夜晾干。 24. 用 200 ml T low E 緩沖液重懸 DNA。用滅菌的 96 孔板蓋子蓋好。使用前在 4℃ 至少放 2 天重新水合（rehydrate）。儲存于 -20℃。 25. 每個待擴增的 96 孔板，配置含有下列組分的 PCR 反應母液： 1000 ul 10×PCR 緩沖液 20 ul 100 mmol/L dATP 20 ul 100 mmol/L dGTP 20 ul 100 mmol/L dCTP 20 ul 100 mmol/L dTTP 5 ul 1 mmol/L AEK M13F 引物 5 ul 1 mmol/L AEK M13R 引物 100 ul 5U/ ul Taq DNA 聚合酶 8800 ul H2O 26. 標記好 96 孔 PCR 板，每孔加入 100 ul PCR 反應母液。輕輕彈動板壁確定沒有氣泡壓在孔底。 27. 每孔加入 1 ul 純化的 EST 質粒模板。確保每次加入模板時槍頭尖伸進反應混合液中。 28. 按下列熱循環程序工作：
PCR 結束后，板子存放在 4℃，此時進行質量控制檢查。 29. 倘若此次為這些 EST 的第一次擴增，每個 PCR 取 2 ul 跑 2％ 的瓊脂糖膠并選用合適的分子質量標準物。如果這批模板先前擴增過，則每個板取一排跑膠檢查。 30. 每個擴增板選一排擴增產物，各取 1 ul 用熒光儀分析。 31. 取 V 型底 96 孔細胞培養板，每孔加入 200 ul 乙醇/乙酸溶液（pH 6）。 32. 每孔 PCR 產物（步驟 28）取出 100 ml 加到對應的 V 型底 96 孔板并吹吸混勻：吸 75 ul， 然后吹出；如此 4 次。 33. 將板子置于 -80℃ 放 1 h 或-20℃ 過夜。 34. 將板子融化冰塊以減少脆性并使孔內可能形成的冰完全融化。 35. 4℃ 條件下 2600 g 離心 40 min。調整微量滴定板清洗儀吸取上清，使約 10～20 ul 留在孔底。 36. 用清洗儀每孔加入 200 ul 70％ 乙醇清洗沉淀。 37. 4℃，2600 g 離心 40 min。用清洗儀吸取上清。板置關閉的抽屜里晾干過夜。 38. 每孔加入 40 ul 3×SSC。用錫箔紙封好，確保每個孔都封緊。 39. 將 3×SSC 浸濕的紙巾與平板一同放入熱密封袋并用加熱封口儀封好袋口。 40. 將袋子放入 65℃ 培養箱 2 h，然后關掉培養箱加熱。 41. 每板選一排孔各取 1 ul 重懸的 PCR 產物，跑 2％ 的瓊脂糖膠。 充分地沉淀和重懸將產生很強的條帶，沒有停留在加樣孔或從條帶到加樣孔的拖帶。 42. 把重懸后的平板放在-20℃。 將 PCR 產物從滴定板轉移到玻片上的點樣儀（printer） 和針（pen） 的品種很多，其應用可在很大程度上避免繁瑣的點樣過程。下面的步驟對這一過程作了大略的描述。 43. 按廠家的說明書清洗針。 44. 安裝帶有多聚賴氨酸封閉玻片的點樣儀玻片架。 45. 將裝有純化 EST 的 PCR 產物的板子解凍，在 20～25℃ 以 167 g 輕微離心 2 min （在水平培養板轉子上是 1000 r/min）， 以除去蓋子上凝聚的水汽或液滴。 46. 取 5～10 ul 純化的 PCR 產物到另一個平板用作點樣溶液。 帶羽管狀針的點樣儀一般需要點樣溶液足夠低，這樣當點樣針下降到孔里的時候，它浸入液面的深度＜1 mm。這樣針旁邊帶出來的液體不會太多，不至于在開始的幾個片子上產生有差異的又較大的點。 47. 設計一個可重復的點樣試驗來檢驗點位模式的大小和形狀，以及在玻片上的放置位置。 48. 如果一個或者多個針頭達不到期望的水平，重新清洗或者換一個新的再試。如果所有的針都正常，就完成所有的點樣。 49. 點樣結束后拿走玻片，用金剛筆在玻片邊緣刻上點樣的識別符和玻片編號。放在無塵的玻片盒里，可以放 1 周。 50. 把玻片點樣面朝上放入耐熱玻璃烘烤盤用塑料膜蓋住，置交聯儀以 450 mJ 能量紫外光曝光。 51. 將玻片裝入 30－玻片不銹鋼架，再將玻片架裝入玻璃罐。 52. 在裝有 325 ml 1－甲基-2-吡咯烷酮的大玻璃燒杯中用磁力勝棒攪拌溶解 6.0 g 丁二酸酐。 53. 往燒杯中加入 25 ml 1 mol/L 硼酸鈉緩沖液（pH 8.0）。讓溶液混合幾秒鐘，然后快速倒進玻片罐。 54. 將玻片罐置于通風櫥內的水平搖床上搖 20 min， 每分鐘 70～90 次。 55. 玻片在搖床上溫育的同時，準備開水以變性玻片上的 DNA。 56. 玻片搖床溫育 20 min 后轉入開水浴。當玻片一沒入開水時立即關閉加熱裝置。開水浴 2 min 。 57. 將玻片轉入裝有 100％ 乙醇的玻璃罐孵育 4 min。 58. 將玻片拿去在 20～25℃ 以 167 g 輕微離心 2 min （在水平培養板轉子上是 1000 r/ min）， 用干玻片。 59. 雜交前將玻片保存于一個干凈、無塵的玻片盒，放過夜。
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| 注意事項 |
操作 1－甲基－2－吡咯烷酮（致畸劑）時應戴腈制（Nitrile） 手套，并在化學通風櫥中工作。
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| 其他 |
1. 材料 保存于細菌中的克隆純的、已測序確證的人 EST 序列（例如，gf211 release， Research Genetics） 2.試劑 LB 培養基（Biofluids），內加 100 ug/ul 的羧芐青霉素（母液 100 mg/ ml） 70％ 乙醇 100％ 變性乙醇（denatured ethanol） 超級肉湯培養基（Biofluids） 內加 100 ug/ul 的竣芐青霉素（母液 100 mg/ml） 45％ （m/V） 甘油（酶級，高壓滅菌，室溫存放） 96 孔堿裂解小抽試劑盒（Edge BioSystems） 裂解液 RNA 酶溶液 重懸緩沖液 96 孔收集板和過濾板 沉淀緩沖液（存放于 4℃） 中和緩沖液（存放于 4℃） 寬口吸頭 深孔板 T low E 緩沖液 10×PCR 緩沖液 100 mmol/L dATP 100 mmol/L dGTP 100 mmol/L dCTP 100 mmol/L dTTP 1 mmol/L PCR 引物 AEK M13F （5’－GTTGTAAAACGACGGCCAGTG －3‘） 1 mmol/L PCR 引物 AEK M13R （5’－CACACAGGAAACAGCTATG －3‘） Taq DNA 聚合酶 （AmpliTaq， PE Biosystems）， 存儲于 -20℃。 乙醇/乙酸溶液 20×SSC 丁二酸酐（Sigma－Aldrich） 1－甲基－2－吡咯烷酮（1－methyl-2－pyrrolidinone） 1mol/L 硼酸鈉，pH 8.0 3.耗材 96 孔圓底和 V 型底塑料細胞培養板（Corning） 帶有水平微孔板架，容得下 6.2 cm 深，可離心微孔板和過濾板的離心機（如 Sorvall Super T21， Sorvall 帶 ST－H750 微孔板架的轉子） 96 針多點復制器（96－uln multi－dot replicator） 家用 1 gal 可密封儲存袋（如 Glad Lock） 深孔板 多微孔膠帶（如 Qiagen 的 Airpore Tape Sheets） 37℃ 可以放置深孔板的控溫臺式搖床 滅菌的 96 孔板蓋（如 Elkay Products） 薄壁 96 孔 PCR 板和 PCR 板蓋子（如 Robbins Scientific 公司的 CycleSeal 蓋子） 96 孔熱循環儀（MJ Research 公司） 微量滴定板清洗儀（如 Bio－Rad 公司 Immunowash Microplate washer） 熱密封儲存袋和加熱封口儀 65℃ 水浴鍋 玻片點樣儀（如 GeneMachines、Genetic Microsystems、Genetix、Cartesian Technologies）和點樣針（如 Majer Precision Engineering、TeleChem International） 在玻片上刻字的金剛石 沒有紙或軟木襯墊的塑料玻片盒（如 PGC Scientifics） 約 24 cm×34 cm×5 cm 耐熱玻璃烘烤盤 多聚賴氨酸封閉的玻片 30－玻片不鎊鋼架和 30－玻片玻璃罐（Shandon/Lipshaw） 1L 玻璃罐
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