7. 盡可能快地進行 cDNA 合成的下一步驟
階段 2:cDNA 第二鏈的合成
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到合適濃度。
氯仿
EDTA(0.5mol/LpH8.0)
乙醇
MgCl2(1mol/L)
(NH4)2SO4(1mol/L)
將 1.3 g 固體硫酸銨溶解于終體積為 10 ml 的水中，溶液經濾膜過濾除菌后，貯存于室溫。
β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD)(50 mmol/L)
將 33.2 mg β-NAD 溶解于 1 ml 水中，制成 50 mml/L 的貯存液，分裝后貯存于-70°C。β-NAD 除可作為電子受體外，也是大腸桿菌 DNA 連接酶的輔因子。不要將其與α-NAD 混為一談。
酚：氳仿（1:1，V/V)
RNase H 緩沖液（選用）
20 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)
20 mmol/L KCl
0.1 mmol/L EDTACpH8.0)
0.1 mmol/L DTT
只有進行步驟 1 的備選步驟時，方需使用此緩沖液，
乙酸鈉（3mol/L,pH5.2)
10XT4 多核苷酸激酶緩沖液
TE(PH7.6)
Tris-HCl(2mol/L,pH7.4)
酶和緩沖液
T4 噬菌體 DNA 聚合酶（2.5 單位/ul)
T4 噬茵體多核苷酸激酶（30 單位/ul)
大腸桿菌 DNA 連接酶
大腸桿菌 DNA 聚合酶 I
RNase H
有數家廠商出售來自大腸桿菌的 RNase H 純品，其比活需達到約 1000 單位/ml。
核酸和寡核苷酸
dNTP 溶液（含有 4 種 dNTP, 每種濃度為 10 mmol/L)
cDNA 第一鏈
使用按本方案步驟 1 制備的第一鏈大規模反應混合物。
參照物
見本方案末疑難解答"cDNA 第二鏈合成的優化"。
放射性化合物
[a-32P]dCTP(10mCi/ml,400Ci/mmol)
不要用 [a-32P]dTTP 作為監視 cDNA 第二鏈合成的放射性示蹤劑。因為它們可能偏愛摻入到對應于 mRNA3'端 poly(A)+尾巴的第二鏈部位。
在開始本方案前，才能融化 [a-32P]dCTP, 將融化的放射性標記的 dCTP 存放在冰上直到步驟 1 需用時。使用后必須立即將放射性標記的 dCTP 放在冷凍室內。
專用設備
SephadexG-50 離心柱
將知 Sephadex G-50(中等大小孔徑）加到無菌水中（10 g 干粉產生 160 ml 懸漿）。用無菌水清洗膨脹的樹脂數次以除去可溶的葡聚糖，否則在乙醇沉淀時由于沉淀可造成問題。最后用含有 10 mmol/L NaCl 的 TE(pH7.6) 溶液平衡樹脂，高消毒 [10 psi(0.70 kg/cm3)15 min] 并儲存于室溫。預裝好的 Sephadex 柱和其他凝膠過濾樹脂有商品銷售。
預設溫度為 16°C 的水浴
方法
用 RNaseH 和 DNA 聚合酶 I 催化合成 cDNA 第二鏈會導致 mRNA 模板 5'端序列的缺失（約 20 個核苷酸)。這是因為在 DNA 聚合酶 I 起始合成第二鏈前，RNaseH 降解了 mRNA-DNA 雜合體的 5'序列（D'Alessio and Gerard 1988)。大多數真核 mRNA 的 5'端含有一大段非翻譯序列，因此缺失相當于 5'端 20 個核苷酸的 cDNA 克隆對大多數研究者將不會產生有害結果。另外，對于那些對 5'端序列非常關心的研究者，我們提供了一種步驟 1 的備選方法，可減少 cDNA 克隆失去 5'端的危險。不幸的是，這種方法可導致雙鏈 cDNA 產量降低，所以大多數研究者愿意選擇步驟 1 的標準方法。
1. 將下列試劑直接加入大規模第一鏈反應混合物中（階段 1, 步驟 4):
10 mmol/L MgCl2 70ul
2mol/LTris-HCl(pH7.4) 5ul
10mCi/ml[a-32P]dCTP(400Ci/mmol) 10ul
1mol/L(NH4)2SO4 1.5ul
RNase H(1000 單位/ml) 1ul
大腸桿菌 DNA 聚合酶 I(10000 單位/ml) 4.5ul
溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機內稍離心，以除去所有氣泡。在 16°C 溫育 2~4 h。
2. 溫育結束，將下列試劑加到反應混合物中；
β-NAD(50 mmol/L) 1ul
大揚桿菌 DNA 連接酶 (1000~4000 單位/ml) 1ul
室溫溫育 15 min。
3. 溫育結束，加入 1ul 含有 4 種 dNTP 的混合物（每種濃度為 10 mmol/L）和 2ul(5 單位）T4 噬菌體 DNA 聚合酶。反應混合物室溫溫育 15 min。
4. 取出 3ul 反應物。按步驟 7 和步驟 8 描述的方法測定第二鏈 DNA 的質量。
5. 將 5ul0.5mol/L EDTA(pH8.0) 加入剩余的反應物中，用酚: 氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在 0.3mol/L(pH5.2) 乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收 DNA, 將 DNA 溶解在 90ul TE(pH7.6) 溶液中。
6. 將下述試劑加到 DNA 溶液中：
10XT4 多核苷酸激酶緩沖液 10ul
T4 多核苷酸激酶（3000 單位/ml) 1ul
室溫溫育 15 min。
7. 測定從上面步驟 4 取出的 3ul 反應物中放射性活度，并按附錄 8 所述方法測定 1ul 第二鏈合成反應產物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8. 用下面公式計算第二鏈反應中所合成的 cDNA 量。要考慮到已摻入到 DNA 第一鏈中的 dNTP 的量。
這里 x 表示 cDNA 第一鏈量（來自階段 1 步驟 6)。DNA 第二鏈合成量通常為第一鏈量的 70%~80%。
9. 用等量酚: 氯仿對含有磷酸化 cDNA(來自步驟 6) 的反應物進行抽提。
10.Sephadex G-50 用含有 10mmol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的 dNTP 和 cDNA 分開（見附錄 8)。
11. 加入 0.1 倍體積的 3mol/L 乙酸鈉（pH5.2) 和 2 倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的 cDNA, 將樣品置于冰上至少 15 min, 然后在微量離心機中以最大速度 4°C 離心 15 min, 回收沉淀 DNA。用手提微型監測儀檢査，是否所有放射性都沉淀下來。
12. 用 70% 乙醇洗滌沉淀物，重復離心。
13. 小心吸出所有液體（檢查吸出的液體中是否完全沒有放射活性)，空氣干燥沉淀物。
14. 如果霈要用 EcoRI 甲基化酶對 cDNA 進行甲基化，可將 cDNA 溶解于 80ul TE(pH7.6) 溶液中（見本方案步驟 3)。另外，如果要將 cDNA 直接與 Not I 或 Sal I 接頭或寡核苷酸銜接子相連（見本方案步驟 4), 可將 cDNA 懸浮在 29ulTE(pH7.6) 溶液。
沉淀的 DNA 重新溶解后，盡快進行 cDNA 合成的下一步驟。
在 cDNA 文庫構建過程中，需多次采用乙醇沉淀 cDNA。因為 cDNA 量常常非常少（經常非常珍貴)，所以必須特別小心，以求 cDNA 回收比例達到最大。有關這方面建議，見附錄 8。