cDNA文庫的構建2

階段 3:cDNA 的甲基化

材料

緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到合適濃度。

氯仿

10XEcoRⅠ 緩沖液

1XEcoRⅠ 甲基化酶緩沖液（選用)
如希望，可替代步驟 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。

EDTA(0.5mol/L,pH8.0)

乙醇

MgCl₂(1mol/L)

NaCl(5mol/L)

酚：氯仿

S-腺苷甲硫氨酸
用一級碘鹽，預制含 5 mmol/L 硫酸和 10% 乙醇的貯存液（20 mmol/L）, 分裝-20°C 保存。當購買 EcoRI 甲基化酶時，New England Biolabs 公司提供 S-腺苷甲硫氨酸溶液。

乙酸鈉（3mol/L,pH5.2）

TE(PH8.0)

Tris-HCl(2mol/L,pH8.0)

酶和緩沖液

EcoRl

EcoRI 甲基化酶
New England Biolabs 公司銷售的酶分離自帶有可表達甲基化酶基因多拷貝質粒的大腸桿菌菌株。

凝膠

瓊脂糖凝膠（1%)(見步驟 8)

核酸和寡核苷酸

雙鏈 cDNA
使用按本方案階段 2 步驟 14 所制備的 cDNA。

線性化質粒 DNA 或λ噬菌體 DNA

兩者中任何一種可用來檢査 EcoRⅠ 位點甲基化效率，線性化質粒在離其末端有一段距離處至少有一個 EcoRⅠ 位點。λ噬菌體 DNA 可像在瓊脂糖凝膠電泳中用作分子質量標準物（如 HindⅢ消化的λDNA) 一樣加以使用，對于質粒 DNA, 用 PstⅠ將 1ug DNA 完全消化，通過酚：氯仿柚提和乙醇沉淀純化 DNA。DNA 溶于 5ul TE(pH7.6) 溶液，-20°C 保存。

專用設備

預設溫度為 68°C 的水浴。

方法

1. 在 cDNA 樣品（來自階段 2, 步驟 14) 中加入以下試劑

2mol/L Tris-HCl(pH8.0)                           5ul
5mol/L NaCl                                            2ul
0.5mol/L EDTA(pH8.0)                            2ul
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸                     1ul
加 H₂O                                                     至 96ul

2. 取出兩小份樣品（各 2ul) 至 0.5 ml 微量離心管中，分別編為 1 號和 2 號，置于冰上。

3. 在余下的反應混合液中加人甲基化酶（80000 單位/ml), 保存在 0°C 直至步驟 4 完成。

4. 再從大體積的反應液中吸出另外兩小份樣品（各 2ul) 至 0.5 ml 微量離心管中，分別編為 3 號和 4 號。

5. 在所有四小份祥品中（來自步驟 2 和步驟 4) 加入 100ng 質粒 DNA 或 500ng 的λ噬菌體 DNA(按材料中所述方法制備）。這些未甲基化的 DNA 在預實驗中用作底物以測定甲基化效率；
重要：在大體積反應中不要加入任何 DNA!

6. 所有四份小樣實驗反應和大體積的反應均在 37°C 溫育 lh。

7. 于 68°C 加熱 15 min，用酚：氯仿抽提大體積反應液一次，再用氯仿抽提一次。

8. 在大體積反應液中加入 0.1 倍體積的 3mol/L 乙酸鈉（pH5.2) 和 2 倍體積的乙醇, 混勻后貯存于-20°C 直至獲得小樣反應結果。

9. 按下述方法分析 4 個小樣對照反應：

a. 在每一對照反應中分別加入：
0.1mol/LMgCl₂                                           2ul
10xEcoRⅠ緩沖液                                      2ul
加 H₂O                                                       至 20ul
b. 在 2 號和 4 號反應管中分別加入 20 單位 EcoRⅠ。

c. 四個對照樣品于 37°C 溫育1h, 通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
瓊脂糖凝膠經溴化乙錠染色后，可見 cDNA 呈彌散的背景。甲基化的 DNA(管 3 和管 4 中的質粒 DNA 或λ噬菌體 DNA) 應對 EcoRⅠ降解有抗性，其大小不會改變；未甲基化的 cDNA 及管 1 和管 2 中的質粒或λ噬菌體 DNA 應該被 EcoRⅠ降解《如果確實_此，可繼續進行第 10 步；否則須重復甲基化反應。

10.(接步驟 8) 微量離心機以最大速度離心 15 min(4°C) 以回收沉淀 cDNA。棄上清，加入 200ul70% 乙醇洗滌沉淀，重復離心。

11. 用手提式微型探測器檢査是否所有放射性物質均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將 DNA 溶于29ulTE(PH8.0)。

12. 盡可能快地進行 cDNA 合成的下一階段。