cccDNA：慢性乙肝持續感染的元兇

　　慢性乙型病毒性肝炎影響著全球超過 2.5 億人口，每年約有 65 萬人死于 HBV 相關終末期肝病。共價閉合環狀（ccc）DNA 是慢性乙肝持續感染的元兇，作為病毒復制的中介，其在宿主肝細胞核內以微染色體的形式存在，目前的治療手段難以將其徹底清除，從而達到慢性乙肝的徹底治愈。

　　Gut 雜志上發表了德國弗萊堡大學醫院 Nassal 教授的一篇綜述，該文概述了 cccDNA 的研究歷史、目前研究中存在的困難、近期的研究進展以及與之相關的治療策略。

　　HBV的感染與復制

　　人 HBV 是嗜肝 DNA 病毒的原型，同屬哺乳動物的正嗜肝 DNA 病毒還有旱獺肝炎病毒（WHV）、地松鼠肝炎病毒（GSHV）、毛猴乙型肝炎病毒（WMHBV）等，此外還有水禽類嗜肝 DNA 病毒，如鴨乙型肝炎病毒（DHBV）、鷺乙型肝炎病毒（HHBV）。

　　HBV 的結構特征

　　如圖 1A 所示，HBV 病毒，或稱「Dane 顆粒」，由含有 3 種外膜蛋白（血清學上的 HBsAg）的包膜包裹核衣殼（血清學上的 HBcAg）構成。核衣殼內包含的病毒基因組是一個部分雙鏈的松弛環狀 DNA，即 RC-DNA。HBV 基因組最顯著的特征在于其結構緊密，功能齊全（圖 1B）。HBV 基因組的開放閱讀框（ORF）存在重合，一個 ORF 可轉錄 2 種 mRNA，編碼 2 種蛋白，所有基因表達和復制所必須的調節原件都埋在基因序列中。

圖1. HBV 的基本分子特征。

圖A為病毒結構；圖B為基因構成（綠色箭頭：啟動子；EnHⅠ/EnH‖：轉錄增強子；DR1，DR2：直接重復序列；紅色波浪線：正鏈DNA上的RNA引物）

　　HBV 的感染與復制

　　如圖 2 所示，HBV 感染肝細胞始于病毒顆粒表面 L 蛋白被肝細胞表面鈉  -牛磺膽酸共轉運多肽（NTCP）受體識別并結合，可能以內吞形式進入細胞。在胞漿中釋放出核衣殼，核衣殼在核心蛋白核定位信號的作用下，進入胞核，并釋放出 RC-DNA，并最終形成 cccDNA。

　　cccDNA 與核小體結合形成獨立于細胞染色體外的微小染色體結構，這一過程有賴于 HBx 和核心蛋白的參與。

　　cccDNA 是病毒轉錄的模板，其利用宿主細胞的 RNA 聚合酶進行轉錄，可產生 3 種亞基因組 RNA，用于合成病毒蛋白，以及 2 種長于基因組的 RNA，用于病毒復制、轉譯核殼等。有效的 cccDNA 轉錄受到肝臟特異性轉錄因子及 HBx 的調控。

　　在細胞漿中，pgRNA 和病毒 P 蛋白一起被新形成的核殼蛋白包裹，在此以 pgRNA 為模板，逆轉錄形成負鏈，隨后 pgRNA 降解，正鏈合成，新的 RC-DNA 形成。含有 RC-DNA 的成熟核心顆粒包裹外膜蛋白，在細胞多泡體的參與下分泌出細胞，此外，新生的成熟核心顆粒還可以再次入核，擴充細胞的 cccDNA 池。

圖2. 肝細胞中HBV的生命周期

（GVG：粘多糖；NTCP：鈉  -牛磺膽酸共轉運多肽）

　　研究 cccDNA 的技術壁壘

　　由上述 HBV 感染的生命周期可見，cccDNA 是 HBV 在肝內進行復制的模板，是建立有效感染的基礎。然而，由于 HBV 的宿主范圍極窄，目前僅有少量、復雜的體外感染系統可用于研究 cccDNA。

　　使用相應宿主的原代肝細胞是解決這一難題的策略之一，但人的肝細胞獲得困難，替代動物樹鼩飼養要求高，價格昂貴。此外原代肝細胞存在最主要的問題在于伴隨著NTCP表達的逐漸缺失，其對HBV的易感性也很快下降。長期HBV易感性可通過向免疫缺陷小鼠移植人或者樹鼩的肝細胞實現，但技術非常復雜。

　　NTCP 作為 HBV 受體這一發現為 cccDNA 的研究提供了極大便利，通過表達 NTCP 受體，實驗中常用的 HepG2、Hu7 等細胞系均可被HBV 感染，但要獲得高感染率仍需在培養體系中加入相當高劑量的病毒顆粒（細胞數量的 10E4 倍）來實現。

　　研究 HBV 的非感染模型，向細胞轉染 HBV 質粒或尾靜脈高壓注射 HBV 質粒等，cccDNA 形成均很少甚至沒有。在這些模型中，質粒替代cccDNA 成為病毒復制的主要模板。與之類似的還有 HBV 轉基因小鼠，其 HBV 基因是整合在小鼠基因組中的。

　　鴨肝病毒模型對 cccDNA 的研究貢獻

　　不同于 HBV，DHBV 在不同的體系中很容易檢測到 cccDNA，而鴨肝細胞也相對容易獲得，體內試驗較為便利。

　　鴨肝病毒模型闡明了 cccDNA 在肝炎病毒復制周期和持續感染中的重要作用，主要研究結果包括：cccDNA 的形成有賴于逆轉錄，而非 DNA 的半保留復制；cccDNA 在細胞核內以 cccDNA 池的形式存在，每個細胞核中往往不止 1 個拷貝；檢測單個細胞核內 cccDNA 的技術。

　　近期有研究利用攜帶一種包膜缺陷 DHBV 病毒的肝細胞系，如 DStet5，包膜蛋白缺陷導致病毒分泌受阻，因此可誘導單個細胞內 cccDNA 水平大幅增加（如圖 3），這種 DHBV 在人的肝癌細胞系內也可達到很高的 cccDNA 水平，從而為 cccDNA 的研究提供了便利。

　　cccDNA的檢測困境

　　Southern blot 檢測敏感性有限

　　由于 cccDNA 呈超螺旋結構，相比與同等長度的 RC-DNA，其具有更高的電泳遷移率，因此 cccDNA 可通過 Southern blot 與其他形式的肝病毒基因組進行鑒別。

圖3. Southern blot 檢測 cccDNA

　　慢性感染鴨肝炎模型顯示單個細胞內平均含有 10 拷貝左右的 cccDNA，不同細胞間拷貝數變化很大，且隨著感染的病程具有時間上的波動。

　　人慢乙肝單個肝細胞拷貝數似乎更低（平均 0.1-1 拷貝 / 細胞），而 Southern blot 檢測下限約為 10 拷貝 / 細胞，因此如此低的 cccDNA 水平使得 Southern blot 難以準確的檢測到單個細胞的拷貝數。

　　所有基于 PCR 的檢測方法，如引物設計在 RC-DNA 正鏈缺失段兩端的「over-gap」PCR，或以環狀 DNA 為模板的滾環擴增，但不能絕對排除 RC-DNA 的干擾。另有非 PCR 的侵入分析技術，利用一條引物與 cccDNA 形成 3 鏈結構，這一結構可被特異性的核酸內切酶識別。

　　總之，最大化 cccDNA 的選擇性，排除 RC-DNA 干擾是準確定量 cccDNA 的關鍵，只對胞核而非全細胞進行檢測，并聯合外源性核酸酶特異性降解 RC-DNA 或為一種解決策略。另外應注意單鏈上的一個缺口即可造成雙鏈解螺旋，導致低估 cccDNA 載量。

　　對研究者而言，應當清楚每一種方法的缺陷，并亟需建立一種標準的高敏感性的檢測方法。對讀者而言，應清楚的認識到，對于已經處于很低水平的 HBV cccDNA，宣稱進一步降低其載量的數據支持或并不充分。

　　cccDNA的生命周期

　　宿主DNA修復系統參與cccDNA的從頭合成

　　侵入肝細胞的 RC-DNA 是 cccDNA 形成的直接前體，由 RC-DNA 形成 cccDNA 稱為「從頭合成」，這一過程需要去除負鏈 5』端的末端 P 蛋白和 3』端的末端過剩段（r），兩端連接成環，同時正鏈的 5』端去除 RNA 引物，3』進行延長，兩端閉合。

　　在 cccDNA 從頭合成過程中，病毒 P 蛋白有部分參與，但宿主 DNA 修復系統在其中發揮了重要作用，主要參與的酶有核酸內切酶、酪氨酰磷酸二酯酶、DNA 聚合酶、多核苷酸激酶或磷酸酶、DNA 連接酶等（如圖 4）。

圖4. RC-DNA 的結構特征

　　cccDNA的確切生命周期尚不清楚

　　核苷類藥物停藥或免疫抑制狀態下病毒反彈提示 cccDNA 可持續存在長達數十年，但目前尚沒有人類 cccDNA 消減動力學數據。土撥鼠和鴨肝感染模型提示 cccDNA 的半衰期為 33 和 57 天。黑猩猩急性感染時，cccDNA 半衰期縮短至 3 天，但仍有痕量 cccDNA 可持續數年。

　　在慢性感染中，新的 cccDNA 的產生與已存在 cccDNA 的消失受到眾多因素影響，二者的綜合結果決定了 cccDNA 池的大小。當前，我們仍無法確切知道單個 cccDNA 分子的生命周期。

　　有待解決的cccDNA生物學問題

　　1、cccDNA 的生命周期取決于單個分子，還是存在 cccDNA 的更新？如果存在更新，那么是經過何種途徑？（細胞內？細胞間？或細胞外？）其動力學特征如何？

　　2、在急性自限性 HBV 感染中，cccDNA 是如何被清除的？

　　3、如果細胞可以從 cccDNA 的層面獲得免疫學治愈，那其具體機制如何？

　　4、cccDNA 在細胞分裂過程中是否存活？如何存活？

　　5、什么因素限制了 cccDNA 在大多數人的肝癌細胞系及鼠肝細胞的形成和積累？

　　6、為什么這種限制在鴨 HBV 并不明顯，甚至是感染人的細胞？

　　7、何種機制限制了 cccDNA 的無限擴增，這種機制可用于減少 cccDNA 的拷貝數么？

　　可能的治療靶點

　　以 cccDNA 作為治療靶點，首先需要闡明 cccDNA 的生命周期取決于單個分子的生命期還是通過更新維持 cccDNA 池。若沒有 cccDNA 的更新，那么阻斷 RC-DNA 向 cccDNA 轉變僅在感染之初有效。

　　在人源化小鼠模型上，低劑量 HBV 感染后予以 NTCP 受體阻斷劑 Myrcludex B 治療，不僅可以阻止病毒播散，還可使已感染細胞 RC-DNA 向 cccDNA 的轉變過程受損。這一結果上需要在臨床研究中加以確認。

　　第二個可能的靶點是宿主 DNA 修復系統。然而，宿主 DNA 修復系統繁雜龐大，且存在代償機制，阻斷其中某條通絡或并不能阻斷 cccDNA 的形成，而大范圍阻斷將影響到細胞本身的 DNA 修復。

　　另一個替代策略是阻斷 RC-DNA 前體入核，RC-DNA 的核轉運依賴于核衣殼，靶向核衣殼的藥物正在研發當中。

　　誘導核衣殼在胞漿分解

　　誘導組裝空的核衣殼或不規則的聚合物，將破壞核衣殼的穩定性，它們或在胞漿中解體，RC-DNA 釋入胞漿，不僅無法達到胞核，反被胞漿 DNA 感受器識別，誘導 1 型干擾素的產生。

　　需要再次強調的是，減少已有的 cccDNA，需要以 cccDNA 池通過更新維持其數量為前提。

　　功能性失活 cccDNA

　　cccDNA 的轉錄受到外部調控，靶向這些細胞調控機制或達到 cccDNA 功能性失活。這類選擇包括干擾素α、靶向 HBx 的藥物，以及 DNA 損傷結合蛋白 DDB1。

　　然而功能性失活 cccDNA 的局限在于在 cccDNA 存續期間需要持續干預。此外，轉染無轉錄活性 cccDNA 的細胞對免疫介導的 cccDNA 清除更加穩定。因此這一觀點需要更多的研究加以證實。

　　直接清除已有 cccDNA

　　肝細胞內 cccDNA 池的穩態取決于 cccDNA 消長的速度。由于 cccDNA 更新動力學尚不明確，清除已有的 cccDNA 似乎是更加直截了當的選擇。在慢性感染條件下，清除已有 cccDNA 有兩種策略，一是免疫介導的 cccDNA 的清除，二是設計核酸酶對基因進行編輯。

　　⑴ 免疫清除

　　天然免疫和適應性免疫在清除急性 HBV 感染時發揮重要作用，慢性 HBV 感染存在免疫應答的不足，重新建立有效的免疫應答意義重大。

　　免疫介導的 cccDNA 清除包括兩個層面：一是從肝細胞內清除 cccDNA，即非溶細胞式清除；二是由殺傷性 T 細胞破壞含有 cccDNA 的肝細胞。兩種機制在急慢性 HBV 感染時都存在，但各自的相對貢獻尚不清楚。

　　近期一項研究提示非常高劑量的干擾素 -α，或有效激活淋巴毒素 -β受體可直接靶向作用于 cccDNA 的完整性，經 APOBEC3A 和 B 介導負鏈去氨基作用，并最終降解 cccDNA。

　　盡管在某些方面存在爭議，Toll 樣受體 7 激動劑 GS-9620 的臨床前試驗結果充滿希望，肯定了激活天然免疫應答的治療價值。

　　⑵ 基因編輯

　　在不同免疫介導的 cccDNA 下降過程中，一部分 cccDNA 似乎相當頑固，難以進一步降低。這或許是含有 cccDNA 細胞本身的特質，也有可能是 cccDNA 存在更難以被分解的形式，例如甲基化、染色體化等。

　　利用核酸酶進行基因編輯的技術進步催生了靶向 cccDNA 的新工具，例如鋅指核酸內切酶、類轉錄激活效應物核酸內切酶、以及 RNA 引導的成簇的規律間隔的短回文重復序列 (CRISPR) 基因組編輯技術。

　　這類新技術仍面臨諸多挑戰，如不能特異性靶向含有 cccDNA 的肝細胞，線性病毒 DNA 整合到肝細胞基因組，以及 DNA 修復系統可能再次生成完整的 cccDNA 等。此外，細胞內過量的 RC-DNA 是否會影響到藥物準確靶向 cccDNA 并不清楚。

　　因此，發展其他新技術，包括治療性疫苗、反義寡核苷酸和基于 RNA 干擾等，仍具有廣闊的空間。

圖5. 靶向 cccDNA 的潛在治療策略

　　總結

　　cccDNA 在 HBV 持續感染中的作用毋庸置疑，治愈慢性乙肝將必須攻克這一難題。

　　目前，受限于體內體外實驗模型的局限，對 cccDNA 的形成、降解等生物學特性的認識仍存在許多空白，隨著細胞感染系統和小動物模型的建立，這些問題有望在不遠的未來得以解答。徹底消除 cccDNA，僅依靠一種策略可能難以實現，聯合對 cccDNA 生化特征的認識、機體在急性感染時免疫系統清除 cccDNA 的方式以及操縱編輯 DNA 的新技術，或有望實現這一目標。

　　希望終有一天，慢乙肝可以像慢丙肝一樣被治愈。