5. circ_104075可以結合miR-582-3p
作者首先想到circRNA通過海綿作用吸附miRNA，直接調控靶蛋白的表達，作者利用miRanda數據庫預測了circ_104075最有可能結合的5個miRNA，接著通過RNA pull down技術（云序生物提供此項實驗）捕獲復合物后RT-qPCR檢測發現只有miR-582-3p存在結合；通過構建突變形式circ_104075和miR-582-3p，熒光素酶報告基因實驗證實了WT circ_104075和WT miR-582-3p的結合，WT miR-582-3p可以抑制WT-、Mut1-和Mut2- circ_104075的酶活性，而抑制不了Mut3 circ_104075的酶活性，提示circ_104075該結合位點的5’和3’端序列對于miR-582-3p的結合至關重要。同時Mut miR-582-3p則無法抑制circ_104075的酶活性。
圖5. circ_104075直接結合miR-582-3p
6. miR-582-3p可以靶向結合YAP-3’UTR
已經證實了circ_104075可以結合miR-582-3p，同時circ_104075與YAP表達成正相關，那么問題來了，miR-582-3p是否靶向調控YAP表達呢？進一步研究證實了miR-582-3p表達與YAP表達的負相關性， 通過預測發現miR-582-3p的5’端可以結合YAP mRNA 的3’UTR的三個位點，對這三個位點進行突變后進行熒光素酶報告基因實驗，發現miR-582-3p無法抑制Mut1-YAP-3’UTR，說明YAP mRNA 的3’UTR（315-321堿基序列）對于miR-582-3p的5’端的結合很重要；通過敲低circ_104075后抑制miR-582-3p，證明了miR-582-3p在circ_104075促進YAP表達過程中發揮著重要作用。
圖6. YAP-3’UTR是miR-582-3p的靶點
7. YAP-3’UTR的m6A修飾水平促進miR-582-3p的結合
通過MeRIP-qPCR（云序生物提供此項實驗）檢測到了P1-YAP-3’UTR (235-419 堿基序列)的表達上調，而該區域對于miR-582-3p的結合也很重要。YAP-3’UTR （235-419區域）中的353-357區域存在m6A motif（RRACU）——AGACU，通過突變這位點堿基后過表達進行MeRIP-qPCR，發現只有不突變最后三個堿基ACU的YAP-3’UTR的m6A修飾水平不會降低。同時熒光素酶報告基因實驗也證實了YAP-3’UTR 353-357區域的AGACU對于miR-582-3p結合后發揮抑制功能來說是至關重要的。臨床組織樣本的MeRIP-qPCR也證實了HCC患者組織的YAP-3’UTR 353-357區域的m6A修飾水平明顯降低，與HCC患者的YAP表達上調存在一致性。
圖7. YAP-3’UTR中的m6A修飾促進了其與miR-582-3p的相互作用
8. circ_104075在HCC中的臨床診斷意義
通過對一系列消化系統疾病的分析發現，相對于其他消化系統癌癥， circ_104075在HCC患者血清中高表達是具有特異性的，并且隨著HCC的進展呈現正相關性，同時手術治療后HCC患者血清中的circ_104075表達水平明顯降低；ROC曲線分析發現，相對于HCC中其他一些應用的生物標志物來說，血清circ_104075表達水平具有更高的敏感性和特異性，提示其可作為診斷HCC的生物標志物從而應用于臨床中(云序生物提供環狀RNA實時定量PCR服務)。
圖8. 血清circ_104075可作為HCC診斷的生物標志物
綜上所述，該研究闡明了circ_104075在HCC中上調的機制以及其下游調控HCC腫瘤發生的機制。并且揭示circ_104075可以作為一種新的肝癌診斷生物標志物和治療靶點。