crystal數字PCR如何實現的核酸絕對定量？

crystal數字PCR技術是一種核酸分子的絕對定量技術，原理是將PCR反應體系分配到大量微小的反應器中，在每個微反應器中包含或不包含 1 個或多個拷貝的目標核酸分子 (DNA 模板) ，進行"單分子模板"PCR 擴增。擴增結束后，通過陽性反應單元(通過終點熒光信號判斷)的數目和統計學方法計算原始樣本中靶基因的拷貝數。工作流程包含4個主要環節，即樣本DNA/RNA的PCR/RT-PCR反應預混、反應預混液的分散或分區、PCR擴增、熒光信號的采集與數據分析（如下圖所示）。

Crystal數字PCR將樣本DNA分散到25000-30000萬個微滴中，使每個微滴中包含或者不包含1個或多個拷貝的目標分子(DNA模板)，所有微滴以2D陣列的形式單層隨機平鋪在sapphire芯片中，進行PCR擴增，擴增結束后讀取各個反應單元的陰性或陽性熒光信號并進行統計學的分析，就可以計算出原始樣本的模板拷貝數。那么我們如何保證每個微滴中只有一個DNA分子呢？

舉例說明：將100個DNA分子分散到100個微滴里，理想情況下，我們希望100個DNA分子平均分布100個微滴中如下圖中A圖所示，但是實際情況是100個DNA分子以隨機的狀態分布在100個微滴中，如下圖中B圖所示。

A．理想情況下的平均分布

B．實際情況下的隨機分布

圖：DNA分子的平均分布（理想情況，A圖）和隨機分布（實際情況，B圖）

如上由于目標DNA分子隨機分布于陽性反應單元中，直接進行對陽性反應單元進行計數統計，不是真實的目標DNA分子拷貝數，每個反應單元中可能含有兩個或兩個以上的目標分子，這時可以使用泊松概率分布公式（1）進行計算。

（1）

上述公式（1）中，λ為每個反應單元中含有的起始 DNA 分子平均拷貝數，p為在一定的λ條件下，每個反應單元中包含k拷貝目標分子的概率。λ由樣品溶液的稀釋系數m（或者分區數）決定，即λ=cm，其中c為樣品的原始拷貝數。當k=0時，即不含目標DNA分子時，p即可為無熒光信號反應單元數與反應單元總數的比值，也就是陰性反應單元的比例，公式（1）可簡化為公式（2）：

（2）

通過終點法檢測，可以的到總反應單元數n和有熒光信號的陽性反應單元數f，所以陰性反應單元的比例即為公式（3）。

（3）

因此得到下面等式：

（4）
對上式兩邊同時以e為底取對數，得到下面等式：

（5）

也就是說利用數字PCR方法進行核酸絕對定量時，只需要通過陰性反應單元的比例和樣品的稀釋系數（或分區數）即可確定反應單元的平均核酸拷貝數，從而實現DNA的精確定量。這就是數字PCR技術如何實現核酸絕對定量的本質。

泊松分布應用與數字PCR結果校正的前提是需要事件均勻一致，包含微滴的體積、幾何參數、PCR反應條件。Crystal 數字PCR通過自動化微滴陣列的方式，實現了微滴的均勻一致和反應條件一致的同時，通過軟件自動對微滴的幾何參數進行質控，并可溯源到單個微滴，給出最可靠的數據結果。

微滴單點溯源