dPCRvs.qPCR我該如何選擇？

　　數字PCR(dPCR)是PCR領域的新浪潮。它的與眾不同之處在于樣品分液。通過微流體芯片、通道或液滴實現分液，而每個都作為單獨的PCR反應，帶來了出色的靈敏度。同時，也無需建立標準曲線。然而，我們究竟應不應該追趕這個新浪潮?這在很大程度上取決于你的應用和所需的靈敏度水平。何時應該選擇dPCR，讓我們聽聽專家的意見。

　　當你需要檢測稀有事件時

　　美國Sangamo BioSciences公司是鋅指核酸酶研究領域的先鋒。它試圖改造DNA結合的鋅指核酸酶，從而定制基因表達，實現基因治療。Sangamo目前正利用數字PCR平臺(QX100系統，Bio-Rad)，開發HIV的功能療法。

　　Sangamo的資深科學家Gary Lee表示：“對于定量PCR能夠給出精確答案的傳統應用，那就沒必要轉向數字PCR。由于我們面對的是低拷貝事件，有時利用qPCR無法獲得答案。數字PCR對我們跟蹤患者的治療進展很關鍵。”

　　HIV+受試者的現有數據表明，HIV DNA整合到宿主細胞基因組中是一個稀有事件，外周血中每1,000-100,000個CD4+ T細胞僅有一個。這種低水平的HIV DNA可維持低水平的病毒復制，特別是在淋巴組織中。因此，Sangamo研究的一個主要挑戰是測定受試者的HIV DNA水平，從而評估新療法的效果。數字PCR技術能實現目標DNA和RNA分子的絕對定量，帶來比qPCR更高的靈敏度、重復性和精確度。

　　當你需要絕對定量時

　　qPCR測定樣品相對于連續稀釋的標準曲線的拷貝數。測定是相對而言，并非樣品本身真正的拷貝數。它在很大程度上依賴于準確的標準曲線。當然，你也要花相當多的時間去建立標準曲線。例如，如果你想要研究一段新穎的重組DNA序列，那么你首先要得到遺傳序列，將它克隆到質粒上，獲得質粒儲液，將質粒線性化，然后檢測引物探針。數字PCR則不需要標準品，從而能節約時間。

　　當你需要檢測細微變異時

　　數字PCR特別適合某些應用，如檢測稀有等位基因、驗證新一代測序實驗，以及確定細微的拷貝數變異。例如，人類基因組中的某些基因存在一定量的重復或突變，而研究人員希望了解特定群體中這種突變對基因表達或疾病風險的影響。為了開展這一研究，你必須精確地測定基因組序列變異的拷貝數。實時定量PCR 可能需要運行多個重復，才能檢測這種細微變異。

　　有時qPCR剛好符合要求

　　Sangamo在同時采用qPCR和dPCR，對于大部分應用，qPCR的表現不錯。正如Lee所說的，兩個系統都能測定樣品中的DNA拷貝數。盡管dPCR直接測定絕對拷貝數，而qPCR依賴標準品，但兩者不應有差異，除非到了qPCR的檢測極限。在正確開展qPCR時，結果也應是重復的。盡管 dPCR對于某些應用更加精確和可靠，但無疑每個反應的成本更高，且目前也存在一些高通量限制。

　　Gary Lee補充道：“dPCR的需求確實是應用依賴的。qPCR應用得如此廣泛，您可以得到很多支持，也有很多試劑可以選擇。只有當你面對某些限制時，dPCR才能真正讓你的研究受益。”