代謝組學：未來新方向

　　 加拿大阿伯特大學生命科學與計算科學教授David Wishart說，我們自身其實就是一大組生化反應，“因此，基因組和蛋白質組不斷進化來支持代謝組，而不是相反的路徑。” Wishart說，有別于其他組學方法，代謝組學提供了一種更加直接的生理狀態檢測方式。代謝組反應營養、脅迫或者疾病狀態的速度比轉錄組或者蛋白質組要快得多。這使得代謝組在許多領域都非常吃香，如環境毒理學、進化和發育、疾病診斷與治療反饋、以及藥物、殺蟲劑和除草劑的研發等。代謝組流動檢測幫助合成生物學家揭示遺傳改變如何影響通路和產物。

　　作為組學家族最年輕的成員，代謝組學發展勢頭正勁。2014年，國際代謝組學學會主辦了他們的第10次年會，與首次會議是同一座城市：日本鶴崗市。“第一年，我們有大約150人參會。”墨爾本大學助理教授、該校的澳大利亞代謝組分站負責人Ute Roessner說，“今年我們有超過500名注冊參會人。而且代謝組學已經成為了每位研究者研究工具的一部分。現在，年輕的研究者定期開展代謝組學工作，作為他們博士工作的一部分。”

　　代謝組學最主要的挑戰根植于它的優點。代謝組數據很強大，因為生物體具有許多的代謝物，包括相關的前體、衍生物和具有一定濃度的降解產物，它們都極具多樣性且變化迅速。這種復雜性需要精妙的分離和檢測方法。代謝組學包括了脂類分析，這是一個極具潛力的發展領域，賽默飛世爾科技公司策略市場部經理黃盈盈（音譯）說：“脂質組學與心血管疾病、癌癥、糖尿病和肥胖癥直接相關。然而脂質在體內的結構和濃度極具多樣性，能達到10倍的變異。”許多生理脂類和其他代謝物共享一種化學組成，僅僅在排列上具有差別。因此，加州大學戴維斯分校教授、西海岸代謝組學中心主任Oliver Fiehn將代謝組學稱為“異構體科學”。

　　儀器的決策樹

　　人們對代謝組學的興趣不斷增長，促使分子分離和檢測儀器的制造商研發出各種針對代謝組學的硬件、軟件和技術支撐。當研究人員需要將這些技術帶進實驗室時，他們面臨著復雜的決策樹。第一個分支就是非靶向還是靶向的分析。非靶向方法在所有可能的組分上聚集數據。靶向分析則聚焦于已知的組分，經常是數量上的變化，例如在脅迫和疾病的反應過程中。

　　核磁共振光譜學（NMR）對于靶向分析來說尤為強大，因為它可定量、可重復，適合于檢測復雜樣品如血液、尿液或僅需少量或不經過處理的少量組織提取物。芬蘭奧盧大學分子流行病學負責人Peter Würtz最近作為共同作者發表了一篇文章，該項工作利用布魯克公司的儀器，將NMR代謝組學應用于數千個愛沙尼亞和芬蘭的生物銀行樣品中。研究團隊找到了四種生物標記，當組合在一起時，與各種情況的猝死風險的提高顯著相關。Würtz指出，這一研究是觀測性的，并沒有探究其機制，但卻展示了NMR在生物標記分析中的能力。然而，使用NMR的代謝組學分析也存在局限，因為它的靈敏性比更加流行的代謝組學方法“質譜分析法（MS）”要低好幾個數量級。

　　質譜需要樣品處理。組分通常需要離子化并經過分離，最常用的方法是氣相色譜（GC）和液相色譜（LC）法。毛細管電泳（CE）能很好地分離極性代謝物，能夠用到與單細胞一般大小的樣品中。毛細管電泳—質譜聯用是人類代謝組技術公司（HMT）的特色產品，而像安捷倫和愛博才思等企業也提供該產品。但是，毛細管電泳技術需要專業的操作者和強大的軟件來分析遷移時間中的漂動，安捷倫代謝組項目經理Theodore Sana說。

　　毛細管電泳—質譜聯用技術的強大之處在于解析那些易于揮發或者能夠通過衍生物揮發出來的物質，例如原初中心代謝的小分子。而液質聯用技術則特別適用于大的、熱不穩定的有機分子，包括許多次生代謝產物、較大的碳水化合物和脂類。一些諸如超高效液相色譜（UPLC，最初由Waters公司研發）、超臨界流體色譜和離子遷移分離法的新進展，提高了速度和分離能力，囊括了非極性分子和具有多種異構體或異位體的組分（例如脂類）。分離方法與質譜分析器偶聯起來，例如飛行時間（TOF）質量分析器，能夠快速、高分辨率地解析大質量范圍的分子。加入四級或線性離子捕獲器可以選擇在離子化過程中產生的特定成分或組分片段。一旦研究者完成了代謝組特性的分類，他們就可以決定是購買儀器還是將樣品送往服務機構。

　　供應和服務商的選擇

　　安捷倫提供有氣質聯用、液質聯用、毛細管質譜聯用和NMR等儀器。Sana 說：“作為單個供應商能提供所有這些技術，包括了硬件、軟件和技術支持，我們具有不可替代的位置。”（島津公司也提供被研究人員推薦為廉價的原初裝置的多種系統。）用戶對安捷倫提供的直觀軟件給予了好評，Sana證實這確實是公司優先考慮的事情。舉例來說，安捷倫的GeneSpring —質模專業版軟件用于多重組學數據的整合分析。Sana 說，“GeneSpring可以使你采用來源于RNA、蛋白質和代謝物完全不同的數據，并將它們動態地映射在生物通路上，就像KEGG（一種代謝通路工具）那樣。” GeneSpring也支持預處理來自其他廠商平臺的數據，例如作為一個電子表格。使用一個通路工具對來源于大量實驗的結果進行可視化，這對于搜集生物學洞察力、計劃接下來的實驗來說十分有用，Sana說。

　　愛博才思專注于液質聯用質譜儀，研究人員高度評價了該儀器快速的數據獲取，卓越的動態范圍，以及定量化和準確的質量能力（通常定義為百萬分之五或更低的精度）。該公司也提供毛細管電泳和離子遷移的選擇。對于代謝組學來說，愛博才思推薦三聯TOF和QTrap系統。公司高級市場經理Fadi Abdi說，“我們的三聯TOF是進行定性定量分析的高分辨率、精確質譜儀，適合于代謝組學的發展。Qtrap是為要求靈敏性、靶向性和定量性的工作流程所設計的。”Abdi這樣解釋，為了鑒定、確認和定量產物，三聯TOF系列的高獲取速度可以在一個液相時間段的單次進樣中同時完成質譜和串聯質譜分析。Qtrap的多重反應檢測器提供父本化合物的數據和由質譜隨后產生的片段，簡化數據處理流程并使研究者對他們的數據具有信心，愛博才思代謝組和脂質組學應用部門研究員Baljit Ubhi說。

　　那些尋找廣泛代謝物覆蓋的研究者可以考慮愛博才思的組合包，融入了愛博才思的高分辨率液質聯用系統和力可公司的高分辨率氣質聯用系統。這一合作為客戶提供了“兩種技術的精華”，力可市場技術部主任 Jeff Patrick說。組合包中包括了來源于Genedata公司的軟件，能夠將來源于兩個平臺的數據整合以提供可靠的代謝組學分析。

　　另一種流行的多功能液質聯用質譜選擇是賽默飛世爾科技公司基于軌道阱（Orbitrap）技術的儀器。軌道阱質譜分析儀通常用于蛋白質組，但是在整合了一個高級分離系統（如UPLC）時，它的高分辨率能力尤其適用于代謝組學的分析，黃盈盈說。平行檢測消除了為了加速樣品分析所需的多重運行。賽默飛世爾科技公司產品線上的最新系統是具有三個質譜分析儀的軌道阱融合三雜交系統。液相分離以后，通過四極孔樣品過濾，并在隨后的軌道阱和線性離子捕獲中進行可能的平行分析。黃盈盈說，三雜交系統的設計初衷是為研究人員提供靈活性與精確的質譜性能。

　　賽默飛世爾科技、愛博才思和布魯克也提供質譜成像的儀器，這也被稱為MALDI成像法。Roessner解釋，這種方法克服了代謝組學的一個局限：代謝物分析通常只能在均一化的樣品或提取物中進行，但是那些特定的細胞和組織卻具有不同的代謝物特征。質譜成像技術為一個纖薄的組織切片（例如，來源于一個器官或植物組織中）提供了代謝物空間分布的圖像。這一過程是使用激光解吸將矩陣處理的樣品進行組分離子化，然后再使用質譜進行分析。對組分進行二維圖像的重建提供了組織間代謝物的定位。

　　Roessner在該項技術中使用了布魯克系統，他說：“盡管仍在初級階段，但這是一種令人興奮的方法。它可以用于觀察肺部樣品中藥物相關代謝物的分布，或者去追蹤環境刺激后，組織中代謝物分布的改變。”賽默飛世爾科技的軌道阱系統在此方法上具有優勢，黃盈盈說：“因為離子是來源于組織的，沒有經過液相分離，你需要一種超高分辨率的儀器，就像軌道阱。”

　　對于不打算購買系統或者傾向于服務所帶來的便捷性的研究者來說，他們也有很多選擇。Biocrates公司和Metabolon公司都面向全球提供質譜代謝組學分析服務。Metabolon公司也涉獵大型、長期的合作，例如Craig Venter的人類壽命項目，Metabolon 公司銷售市場高級副總裁Chris Bernard說，在代謝組學如何付諸實踐、如何用于一系列項目中的問題上，合作對于Metabolon公司而言很重要。

　　NMR代謝組學所具備的優勢在于不通過標準曲線的真正定量，樣品可保留，可實現最少樣品的操作，單次反應就能檢測到所有帶有結構信息的代謝物。但是科學家對于它的興趣可能會受到裝機成本的阻礙。研究人員可以通過服務商來獲取這種方法，例如Chenomx公司。Würtz和他的同事也通過Brainshake公司提供NMR代謝組學的服務與合作。這是建立在他們使用NMR進行生物標記研究的經驗，并將代謝組學數據與全基因組關聯研究聯系起來，該研究將遺傳變異和疾病風險聯系在一起。

　　代謝組學服務機構正在通過國家和學術中心設施快速增長。在澳大利亞，Roessner屬于第一批建立政府資助的國家代謝組服務平臺。加拿大也資助國家代謝組的項目，其他國家也在這個領域跟進。在美國，國立衛生研究院（NIH）共同基金早在2012年就開始建立代謝組學的區域中心。負責西海岸項目的Fiehn說：“這些中心提高了代謝組學的能力，能夠為學術界和產業界服務，而且他們有不同的特色，例如肯塔基中心的代謝流平臺和北卡羅來納的核磁共振平臺。”國立衛生研究院的中心平臺也為初次接觸代謝組學的科學家提供短期課程。

　　下一步挑戰

　　當被問到代謝組學面臨的重大挑戰時，研究人員和供應商一致認為有三點：對未知物的鑒定；研發出可供查詢的標準數據集，就像GenBank的基因組資源；代謝組學與其他全系統數據的整合。

　　“質譜太過于敏感，因此我們得到了大量物質，卻不知道它們是什么。”Wishart說。為了幫助研究者進行代謝物鑒定，安捷倫研發了氣質和液質聯用質譜的數據庫，專供基于質譜技術的代謝物鑒定。力可公司提供了一個GC-TOF的數據庫，據Patrick表示可用于任何氣相色譜的數據，盡管該數據庫是為力可公司的儀器而進行的優化。力可公司目前正在探索與高分辨率精確質譜庫進行合作的機會。

　　Wishart意識到，最未知的是代謝物中的代謝物：“分解產物和由酶轉換而來的或者具有微生物活性的分子。”這種分子的相似性是鑒定它們的關鍵因素。Fiehn團隊研發了一些商業化的質譜文庫，也在開發虛擬文庫。研究人員可以從物質已知的譜圖數據出發，來預測相似的或修飾變異物的譜圖。LipidBlast是Fiehn團隊開發的串聯質譜虛擬譜庫，超過20萬種脂類可供免費下載。

　　為了面對數據整合和可搜索性所帶來的挑戰，代謝組界采取了一些舉措，推動數據存儲庫的建立。例如位于英國的Metabolights是由歐洲代謝組學標準協調委員會（COSMOS）聯盟所支持的，該聯盟制定了代謝組學的數據標準。還有代謝組學工作平臺（Metabolomics Workbench），該平臺旨在建立國立衛生研究院資助下的代謝組項目的數據庫。賽默飛世爾科技與Fiehn合作推出了mzcloud.org網站提供免費的社區數據庫，數據庫包括在鑒定時有待注釋的未知組分的真實和虛擬譜圖。

　　即便是在代謝組學界有了存儲數據的數據庫之后，Patrick仍意識到，鑒于大量數據的背景和意義，“系統生物學的首要挑戰是生物學干擾”。他認為解決的方案是軟件，這“驅動著代謝組學的發展方向。” Bernard也有同感，他表示Metabolon公司客戶首要的需求是幫助他們理解結果的生物學意義，“質譜對于產生數據來說很不錯，挑戰在于從噪音中分離出信號：85%的質譜數據點都是噪音”。Metabolon公司的客戶可以使用MetaboLync的門戶網站，其中包含了他們樣品中的一系列代謝物，對比擁有超過1.4萬種組分的本地文庫，用于自動認證代謝物的鑒定，Bernard補充道，另外該門戶最強大的特性在于，它具有在通路水平可視化并探索數據的能力。

　　隨著該領域的不斷發展，儀器供應商和服務提供商都迫切地期待與用戶在他們的代謝組學研究上展開合作和討論，不僅是買賣關系，而且可以掌握當前動態。“我們正與一些科研人員開展密切合作。”Sana 說，“在推進代謝組學領域的發展中，研究人員往往是新點子的來源。”

（譯者之一高大海系中國科學院海洋研究所助理研究員）

Chris Tachibana 是美國西雅圖和丹麥哥本哈根的科學作家。