DNA電泳（agarose膠）

利用DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時具有的電荷效應和分子篩效應。

電荷效應是指DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電，在電場中向正極移動，且相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，能以相同速率移動。通常，DNA泳動速率隨DNA片段長度的增加而減少，與電場強度成正比。

分子篩效應是指作為支持介質的瓊脂糖，具有網絡結構，使大分子物質在通過時收到較大阻力，依此分離不同大小的DNA片段。一般，DNA瓊脂糖凝膠電泳可分離50bp到百萬bp長度的DNA片段，視實際需求配制不同濃度和構型的瓊脂糖凝膠。

DNA樣品

瓊脂糖 電泳緩沖液溴化乙錠 上樣緩沖液

電泳儀電泳漕 透射紫外燈 膠帶紙 紫外成像儀

一、標準瓊脂糖不同濃度分離DNA片段的范圍

瓊脂糖/%          分辨DNA大小的范圍

    0.5                    700bp~25kb

    0.8                    500bp~15kb

    1.0                    250bp~12kb

    1.2                    150bp~6kb

    1.5                      80bp~4kb

二、電泳緩沖液配制

以Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（pH8.0，TAE）為例

緩沖液                工作液                                       貯存液/L

  TAE         1X                                        50X

                 40 mmol/L Tris-乙酸鹽         242g Tris

                 1 mmol/L EDTA                    57.1ml 冰乙酸

                                                            100 ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

三、瓊脂糖凝膠制備

1. 將清潔干燥的塑料托盤放入配膠板，置于水平面上。

2. 配制足量的電泳緩沖液（1XTAE）用以灌滿電泳槽和配制凝膠。

3. 根據欲分離DNA片段大小用電泳緩沖液配制適宜濃度瓊脂糖溶液：準確稱量瓊脂糖干粉加到盛有定好量的電泳緩沖液的三角燒瓶或玻璃瓶中。

4. 在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。

5. 用隔熱手套或夾子轉移三角燒瓶或玻璃瓶到55℃水浴。待熔化的凝膠稍冷卻后加入溴化乙錠，終濃度為0.5 μg/ml。輕輕地旋轉以充分混勻凝膠溶液。

6. 瓊脂糖溶液正在冷卻時，用一個合適的梳子形成加樣孔。梳齒的位置應在托盤底面上0.5~1.0mm，這樣瓊脂糖澆灌到托盤時將形成符合要求的加樣孔。

7. 澆灌溫熱的瓊脂糖溶液進入模具，室溫下放置30~45min，待凝膠溶液完全凝結，小心拔出梳子。

四、DNA電泳

1. 將凝膠安放在電泳槽內，向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒過凝膠約1mm。

2. 混合DNA樣品和一定比例的載樣緩沖液。

3. 用微量移液器及一次性吸頭將樣品混合液緩慢加至浸沒凝膠的加樣孔內。分子質量標準應分別加至樣品孔的左側和右側的兩個孔內。

4. 關上電泳槽蓋，接好電極插頭。DNA應向陽極（紅色插頭）側泳動。給予1~5V/cm的電壓，其中距離以陽極至陰極之間的測量為準。

5. 當DNA樣品或染料在凝膠中遷移了足夠距離時，關上電源、拔出電極插頭和打開電泳槽蓋，用紫外燈觀察凝膠和拍照。

1. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。

2. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，熔化的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡，以免影響電泳結果。

3. 電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強度和pH，應經常更新電泳緩沖液。

4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5微克的DNA量，加樣量的多少依據加樣孔的大小及DNA片段的數量和大小而定。當加樣孔大時，樣品上樣量應相應加大，否則會造成條帶淺甚至辨認不清；反之則應適當減少加樣量，因為上樣量過多會造成加樣孔超載，從而導致拖尾或彌散，對于較大的DNA片段，此現象更明顯。

5. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA遷移率，平行對照樣品應使用相同的緩沖條件以消除這種影響。

6. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度、遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段DNA的檢測應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以提高分辨率。

常見問題原因分析

1. 跑出的DNA帶模糊？

（1）DNA降解：避免核酸酶污染。

（2）電泳緩沖液不新鮮：電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液。

（3）所用電泳條件不合適：電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度<30℃；巨大DNA鏈電泳，溫度應<15℃；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。

（4）DNA上樣量過多：減少凝膠中的DNA上樣量。

（5）DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。

（6）有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。

（7）DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

2. 有不規則DNA帶遷移？

（1）對于λ/Hind III片段cos位點復性：電泳前于65℃加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。

（2）電泳條件不合適：電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度<30℃；經常更換電泳緩沖液。

（3）DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

3. 跑出的DNA條帶弱或無條帶？

（1）DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量。

（2）DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

（3）DNA走出凝膠：正確連接電極方向避免插反的情況，縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。

（4）所用光源不合適：對于用EB染色的DNA應用短波長（254nm）紫外光源。

4. 跑出的DNA帶缺失不完整？

（1）如果是小DNA帶，可能跑出凝膠，可以縮短電泳時間或降低電壓或增強凝膠濃度。

（2）分子大小相近的DNA帶不易分辨，應延長電泳時間，并核準正確的凝膠濃度。

（3）DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

5、實驗方法出處來源《分子克隆實驗指南》。