實驗方法：eccDNA-seq
文章內容
1. 血漿中eccDNA檢測
eccDNA高通量檢測的關鍵步驟是要通過實驗手段對其進行有效的富集。研究者通過線性DNA的去除、eccDNA的純化、建庫、測序，生物信息分析對反式剪切位點（junction site）的識別從而完成對eccDNA的鑒定。5例孕期女性的血漿樣品中eccDNA的富集與高通量測序結果顯示：1）核酸外切酶V（exoV）去除線性DNA的過程對eccDNA的富集效果非常明顯；2）同一個體血漿中的eccDNA與線性DNA相比最顯著的特征在于長度分布。線性DNA長度在166bp左右富集，而MspI方法純化的eccDNA主要在202和338bp處有明顯集中，并且338bp處的eccDNA數目要明顯多于202bp附近的eccDNA個數。
圖1 線性DNA和eccDNA長度比較
2. 胚胎源和母源eccDNA檢測比較
之前的研究結果顯示胚胎源（fetal origin）和母源（maternal origin）血漿中線性DNA分子在長度分布不同，通過SNP的方式對eccDNA分子進行來源分類，結果顯示5例孕期女性個體的eccDNA長度均在約202bp和約338bp兩個地方有明顯富集，但是總體來講累積分布曲線顯示胚胎源eccDNA長度分布總體位于左側，換言之胚胎源的eccDNA長度要短于母系eccDNA，這種趨勢和兩種來源線性的DNA長度的差異趨勢保持一致。
圖2 eccDNA長度分布和來源多樣性
3. eccDNA的片段化方法優化
此項研究當中使用的MspI處理方法有一個缺陷，就是MspI總是識別酶切位點的特征序列CCGG，這種識別模式對于長片段eccDNA更有利，因為該分子更有可能含有CCGG序列，利用Tn5隨機剪切的特性能夠有效的解決這一問題，極大的提高eccDNA的檢出。數據分析結果顯示胚胎源eccDNA長度主要分布在202bp和338bp附近，相比于母源eccDNA，胚胎源的分子長度相對較短。
圖3 eccDNA MspI和Tn5剪切效果對比
4.母體血漿中eccDNA基因組注釋
母體血漿當中的eccDNA分子主要來源于5’UTR區，外顯子區以及CpG島，在Alu原件相對較少。這一分布規律和小鼠組織、非孕期人群血漿當中的eccDNA分布保持一致。eccDNA的來源位置并非完全隨機，而是具有一定的偏好性，但母源和胚胎源的eccDNA分布無明顯統計學差異。通過比較eccDNA反式剪切位點發現，少數剪切位點（322，0.018%）在5例孕期個體當中都被檢測到。
圖4 eccDNA的染色體分布
5. eccDNA形成位點的motif探索
eccDNA的反式剪切位點附近是否有motif特征性序列可以闡釋eccDNA的成環機制？文章中對成環片段的上游和下游序列進行了進一步討論，剪切位點上下游各50bp左右的位置的motif分析結果明確了4bp的“空間隔板”，文章中把這種模型描述為“重復模式（recurrent pattern）”。在S1、S2兩側分別由四個重復區域，1區和3區序列相同，2區和4區相同，計算機模擬顯示出現這種模式的概率是0.056%，而測序結果當中為3.484%，這種模型非常有利于同源重組和微同源介導的末端剪切，而這一現象也符合經典的eccDNA成環機制。
總結
本篇文章聚焦孕期女性血漿當中的eccDNA檢測。不同于線性DNA，eccDNA長度更長，母系來源的eccDNA比胚胎來源的eccDNA分子長度也更長。成環位點上下游的信息有效的提示了可能的eccDNA形成機制，為接下來eccDNA的進一步研究奠定基礎。這些成果都有利于推動eccDNA在液體活檢以及生物標志物方面的應用。
2020年年初的寒潮并不能冰凍eccDNA在科研界的火熱。重量級期刊的文章發表已經為我們一年的科研指明了方向，游走在線性DNA之外的eccDNA將是生物醫學領域最閃亮的星。新分子，新方向，機遇與挑戰并存，運氣與實力同在，祝愿各位生物醫學的工作者在新的一年能搶占先機。