共聚焦激光掃描顯微鏡的應用及熒光探針

一、LSCM常用的檢測內容及其熒光探針

LSCM檢測內容和應用范圍非常廣泛，以下僅簡單介紹LSCM常用的檢測內容及其熒光探針。

1．細胞內游離鈣　共聚焦激光掃描顯微鏡常用的有Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，前兩者為單波長激光探針，利用其單波長激發特點可直接測量細胞內Ca2+動態變化，為鈣定性探針；后兩者為雙波長激發探針，利用其雙波長激發特點和比率技術，能定量細胞內i，為鈣定量探針。

定量細胞內[Ca2+]i也可用雙波長激發探針Indo-1和Fura-2。由于這些探針須用比率技術，因此又稱為鈣比率探針。

鈣比率探針在溶液中均有熒光，測量時須洗去細胞外液探針，而進入細胞后的探針其AM被分解后不能透出質膜。由于這些探針要用紫外激發光作激發光源，會造成細胞的損傷，還會增加潛在的自發熒光，而且熒光發射峰波長也較短，須提高發光強度，因而其使用受到一定的限制。

2． DNA和RNA?搖核酸的熒光探針　用于共聚焦激光掃描顯微鏡的主要有Acridine Orange(吖啶橙，AO)、Propidium Iodide(碘化丙啶，PI)。兩種染料既可標記DNA又可標記RNA，如為獲得單獨的DNA或RNA分布，染色前可用RNA酶或DNA酶處理細胞。PI不能進入完整的細胞膜，故不能標記活細胞內的DNA和RNA。

3． 膜電位 以往測定膜電位多用微電極直接插入法測量，不僅操作麻煩，而且對細胞也是一種損傷。共聚焦激光掃描顯微鏡則可利用熒光探針在細胞膜內外分布的差異測出膜電位，不但可以觀察細胞膜電位的變化結果，更重要的是可以用于連續監測膜電位的迅速變化。

膜電位熒光探針根據其對膜電位變化反應速度的快慢分為快、慢兩類探針，各類均有10多種。DiBAC4(3)為最常用的膜電位熒光探針，DiBAC4(3)為帶負電荷的陰離子慢反應染料。該探針本身無熒光，當進入細胞與胞漿內的蛋白質結合后才發出熒光，測量時要求細胞浸在熒光染料中。

當細胞內熒光強度增加即膜電位增加示細胞去極化；反之，細胞內熒光強度降低即膜電位降低示細胞超極化。Rhodamine 123主要用于線粒體膜電位測量。Rhodamine123是一種親脂性陽離子熒光探針，當線粒體膜內側負電荷增多時，熒光強度增加，與DiBAC4(3)的表示形式相反。

4． pH值 正常細胞胞漿內的pH一般在6.8～7.4的范圍，而某些細胞器如溶酶體的pH則在4.5～6.0之間。根據檢測對象pH的不同將熒光探針分為用于偏中性和酸性兩類。常用于偏中性pH即細胞胞漿pH檢測的熒光探針有SNARF類(SNARF-1、SNARF-calcein)、SNAFL類(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等，這些探針均為疏水性探針，須使用其AM形式。

FITC-dextran則適用于pH范圍4～6之間，如溶酶體pH的檢測，該探針也不能透過質膜，但可通過細胞胞飲作用進入溶酶體，因此應選擇分子量稍小的Dextran(葡聚糖)。

5． 細胞內活性氧基 活性氧(active oxygen species)可影響細胞代謝，與蛋白質、核酸、脂類等發生反應，有些反應是有害的，因此測量活性氧在毒理學研究中有一定的意義。根據檢測活性氧的不同可選擇不同的熒光探針。

常用熒光探針有Dichlorodihydrofluorescein diacetate(2，7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸、H2DCFDA)，其原理是不發熒光的H2DCFDA進入細胞后能被存在的過氧化物、過氧化氫等氧化分解為二氯熒光黃（dichlorofluorescein，DCF)而產生熒光，其反應靈敏到10～12 mole水平，熒光強度與活性氧的濃度呈線性關系。

6． 細胞間通訊 共聚焦激光掃描顯微鏡可采用熒光光漂白恢復(fluorescence recovery after photobleading，FRAP)技術檢測細胞縫隙連接通訊，該方法的原理是一個細胞內的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發光能力。

而臨近未被漂白細胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴散到已被漂白的細胞中，熒光可以逐漸恢復。由于光漂白過程是不可逆的，因此可通過觀察已發生熒光漂白細胞其熒光恢復過程的變化量來判斷細胞縫隙連接的通訊功能。

采用FRAP技術檢測細胞間通訊常用熒光探針是6-carboxyfluorescein diacetate(6-羧基熒光黃乙酰乙酸鹽、CFDA)，需用其酯化形式CFDA-AM。該技術可用于研究胚胎發生、生殖發育、神經生物學、腫瘤發生等過程中縫隙連接通訊的基本機制和作用。

由于某些毒性物質尤其是促癌物可影響縫隙連接介導的物質運輸，因此該方法也可用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學物質。

7． 細胞膜流動性 采用熒光光漂白恢復(FRAP)技術還可對細胞膜流動性進行研究。利用NBD-C6-HPC熒光探針標記細胞膜磷脂，然后用高強度的激光束照射活細胞膜表面的某一區域(1～2μm)，使該區域的熒光淬滅或漂白，再用較弱的激光束照射該區域。可檢測到細胞膜上其他地方未被漂白的熒光探針流動到漂白區域時的熒光重新分布情況。熒光恢復的速率和程度可提供有關的信息。

8． 細胞亞微結構(細胞器探針)?搖 一般的光學顯微鏡由于分辨率有限，在觀察細胞器結構時受到一定的限制，而共聚焦激光掃描顯微鏡可獲得較一般普通光學顯微鏡分辨率高的細胞內線粒體、高爾基復合體、內質網、溶酶體等細胞器圖像，同時還可動態觀察活細胞狀態下細胞器的形態學變化情況，此外還可通過光學切片即斷層掃描技術進行三維重建，顯示細胞器的空間關系及其變化。

適用于線粒體的熒光探針較多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、羅丹明 123等。高爾基復合體常用的熒光探針有NBD 酰基鞘氨醇（ceramide）、BODIPY 酰基鞘氨醇。內質網主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶體的熒光探針有DAMP、neutral red。

9． 標記抗體、配體等常用的熒光探針 共聚焦激光掃描顯微鏡不僅可用免疫熒光分析固定的細胞或組織切片，還可用于分析活細胞，得到特異性抗體或其他熒光免疫探針識別靶分子的表達、定位、分布變化等信息。

標記抗體、配體或蛋白質等較通用的有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)，在堿性條件下FITC的異硫氰酸基與免疫球蛋白的自由基經碳酰胺化而形成硫碳胺基鍵，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個IgG分子上最多能標記15～20個FITC分子。

但FITC易產生光漂白現象，發射帶較寬，故在用于雙標記時會和其他染料的發射帶重疊，且帶負電荷，對pH值的變化較敏感，因而限制了其在活細胞檢測中的應用。

10． 檢測酶活性的熒光探針 共聚焦激光掃描顯微鏡除了具備熒光顯微鏡檢測熒光酶細胞化學的作用以外，在檢測活細胞酶活性動態變化方面有著無可比擬的優勢。通過對細胞施予不同的處理因素可檢測細胞內相應的酶被激活或滅活的動態變化過程。有的酶熒光探針是自身就可發出熒光、有的是與酶結合后發出熒光、有的則是被酶分解后發出熒光。

以往記錄熒光信號的儀器主要有熒光顯微鏡、熒光分光光度儀、流式細胞儀等。與這些儀器相比，共聚焦激光掃描顯微鏡不僅可廣泛用于熒光定性、定量測量，同時具備細胞斷層掃描、三維圖像重建、活細胞動態熒光監測、熒光光漂白恢復、激光顯微外科等方面的功能。

此外，共聚焦激光掃描顯微鏡還可用于多重熒光染色的檢測，如同時觀察細胞膜、細胞器、細胞核結構，也可同時檢測細胞內游離鈣和pH或膜電位等的動態變化。總而言之，共聚焦激光掃描顯微鏡可進行多參數、多功能的研究，且快速準確、自動化程度高，是檢測組織細胞熒光信號的最為新穎和先進的技術手段。

二、共聚焦熒光探針的選擇

共聚焦激光掃描顯微鏡是20世紀80年代來發展起來的一種新型高精度顯微鏡系統，輔以各類熒光探針或熒光染料與被測物質特異性結合，不僅可觀察固定的細胞、組織切片，還可對活細胞的結構、分子、離子進行實時動態地觀察和檢測。

熒光探針的發展非常迅速，目前僅美國Molecular Probes公司就可提供1800多種熒光探針，每年該公司還不斷推出新的熒光探針。通常每項檢測內容或被測物質都有幾種或幾十種有關的或特異的熒光探針。

1． 選擇熒光探針的一般考慮　選擇合適的熒光探針是有效地進行實驗并獲取理想實驗結果的保障。熒光探針的選擇主要從以下幾個方面考慮。

（1）儀器所采用激光器的類型：應根據儀器采用激光器的類型進行探針選擇。如共聚焦激光掃描顯微鏡(Bio-Rad 1024，美國Bio-Rad公司產品)采用氪/氬離子激光器，激發波長為488nm，568nm，647nm，可激發多種熒光探針。

（2）熒光探針的光穩定性和光漂白性：在進行熒光定量和動態熒光監測時，要求熒光探針有較高的光穩定性，也可通過減少激光掃描次數或降低激光強度的方法，來減輕光漂白的程度。但在進行膜流動性或細胞間通訊檢測時則需要熒光探針既有一定的光穩定性又要有一定的光漂白性。

（3）熒光的定性或定量：僅做熒光定性或僅是觀察熒光動態變化時，選擇單波長激發探針，無須制作工作曲線。做定量測量時最好選用雙波長激發比率探針，利于制定工作曲線。

（4）熒光探針的特異性和毒性：盡量選用毒性小、特異性高的探針。

（5）熒光探針適用的pH：大多數情況下細胞的pH在生理條件下，但當pH不在此范圍時，考慮適用該環境pH的熒光探針是有必要的。同時應注意染液自身的pH值會影響帶電荷的熒光探針與胞內組分之間的結合，因此在染液的配備時須加以考慮。

2. 使用熒光探針的注意事項　不同的熒光探針在不同標本的效果常有差異，除綜合考慮以上因素以外，有條件者應進行染料的篩選，以找出最適的熒光探針。

此外，許多熒光探針是疏水性的，很難或不能進入細胞，須使用其乙酰羥甲基酯(acetoxymethyl，AM)形式，也就是熒光探針與AM結合后變成不帶電荷的親脂性化合物方易于通過質膜進入細胞，在細胞內熒光探針上的AM被非特異性酯酶水解，去掉AM后的熒光探針不僅可與細胞內的靶結構或靶分子結合且不易透出質膜，從而能有效地發揮作用。