簡介
HERG (human ether-a go-go-related gene) K+ 通道在心臟中高表達，是心肌動作電位三期快速復極化電流(IKr)的主要組成部分(Curran ‘95; Sanguinetti ‘95)。hERG 突變引起的功能缺失常伴隨一些遺傳性長QT 綜合癥(LQTS) 并且會增加發生嚴重的室性心律失常, 扭轉性實行心動過速 (Tanaka ‘97; Moss ‘02)的風險。HERG 鉀離子通道被作用于心臟或非作用于心臟的藥物抑制，都被證實有非常大的可能性出現獲得性藥物誘導的長QT 綜合癥(LQTS)，甚至導致猝死(Vandenberg, Walker & Campbell ‘01)。實際上，hERG 鉀離子通道被抑制引起的副作用是近年來藥物撤市的要原因，因而藥物作用于外源性表達于哺乳動物細胞的hERG 通道的體外效應評價已被 國際藥品注冊協調會議（International Conference on Harmonization）推薦作為臨床前安全性評價工作的一部分(ICHS7B Expert Working Group, ‘02)。hERG 鉀離子通道藥物效應評價的金標準方法是手動膜片鉗記錄。然而，這種低通量、高成本的方法在大量的安全性篩選實驗中非常受限制。近年來，全自動膜片鉗技術發展越來越成熟，可以獲得高通量的、可與手動膜片鉗記錄結果相媲美的數據。IonFlux? 系統結合了讀板機的便捷和傳統膜片鉗技術的優秀性能。本文主要利用IonFlux 系統記錄了在哺乳細胞中表達的hERG 電流以及一些陽性抑制劑對hERG 阻斷效應的藥理學特性分析。
材料和方法
細胞
實驗中使用G418 篩選的穩定表達hERG 通道的CHO 細胞（Millipore PrecisION? hERG-CHO Recombinant Cell Line, Cat# CYL3038）。細胞培養在含10%胎牛血清的Glutamax DMEM/F12 培養基 (Gibco,Cat# 11320) ，加有1% 青霉素-鏈霉素以及500 μg/mL G418。實驗前至少提前24 小時將細胞轉移至30℃培養箱中，或傳代后一直放置在30℃培養箱中。細胞密度不能超過90%。收集細胞時，使用Detachin(Genlantis, San Diego, CA, Cat# T100100)消化細胞，沖洗并輕柔吹打，最后細胞懸浮在細胞外液中，濃度為每毫升2-5 百萬個細胞。
溶液和化合物
細胞外液成分（ECS）含有（mM）：NaCl 145, KCl 4, MgCl2 1, CaCl2 2,HEPES 10, 葡萄糖 10，用NaOH 調pH 至7.4 。細胞內液成分（ICS）含有（mM）：KCl 120, HEPES 10, Na2ATP 4, EGTA 10, CaCl2 5.374,MgCl2 1.75，用KOH 調pH 至7.2。
hERG 抑制劑購自Sigma。化合物第一步全部溶于DMSO 中，制成高濃度的母液（10-50 mM），然后按照濃度梯度和最終外液中的終濃度的倍數關系進行下一步的稀釋，因而最終相應的DMSO 濃度為（0.1- 0.3%）。DMSO 溶液（0.1- 0.3%）作為陰性對照的記錄始終開始于抑制劑作用之前，且規定不能對電流幅度的影響超過10%。
Figure 1. IonFlux 高通量全自動膜片鉗系統，采用“讀板機”式模式，簡化了工作流程、增加了實驗通量。系統配有16 通道和64 通道兩種型號，每天可以記錄獲取10,000 個數據點。