實驗概要
需要偶聯二抗的 ELISA 測定的一般程序。
實驗步驟
1. 將抗原包被到微孔板
1) 將抗原在 PBS 或其它碳酸鹽緩沖液中稀釋至 20 μg/ml 的最終濃度。移取 50 μl 抗原稀釋液到 PVC 微量滴定板的第一排微孔中，使該微量滴定板的微孔上包被抗原。按需要在微量滴定板上進行梯度稀釋。
通常將含純抗原的試樣以低于 2 μg/ml 的濃度加到微量滴定板上。純溶液不是必需的，但是原則上，試樣中超過 3% 的蛋白質應為靶蛋白（抗原）。抗原蛋白質濃度不應超過 20 μg/ml，因為這將使微量滴定板上的大部分可用位點飽和。 | |
確保樣品所含抗原的濃度在抗體檢測范圍內。 |
2) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時，或在 4℃下孵育過夜。包被孵育時間可能需要某些優化。
3) 棄去包被液，并在微孔中加入 200 μl PBS，洗滌微量滴定板三次。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余液滴。
2. 封閉
1) 通過每孔添加 200μl 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉或 5% 血清/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。替代封閉劑包括 blockACE 或 BSA。
2) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少 2 小時，或如更方便的話，則在 4℃下孵育過夜。
3) 用 PBS 洗滌微量滴定板兩次。
3. 用一抗和二抗孵育
1) 將 100 μl 已稀釋的一抗添加到每個孔。
2) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時。此孵育時間可能需要優化。2 小時通常足以獲得強信號，但如若獲得弱信號，則當在 4℃下孵育過夜時往往會觀察到更強的染色。
3) 用 PBS 洗滌微量滴定板四次。
4) 添加 100 μl 偶聯二抗，其在使用前便已在封閉緩沖液中稀釋成最佳濃度（依照制造商說明書。
5) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 1-2 小時。
6) 用 PBS 洗滌微量滴定板四次。
4. 檢測
雖然有許多不同類型的酶可用作檢測，但是辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 測定中廣泛使用的兩種酶。某些生物材料具有高水平內源酶活性（例如肺泡細胞中的高水平 ALP、紅細胞中的高水平過氧化物酶），考慮到這一事實是非常重要的，這可能會導致非特異性信號。如有必要，用左旋咪唑（針對 ALP）或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液（針對過氧化物酶）進行另外的阻斷處理。
5. ALP 底物
對于大多數應用，pNPP （對硝基苯磷酸鹽）是最常用的底物。在室溫下孵育 15-30 分鐘后，可在 405 nm 處測定硝基苯酚呈現的黃色。（該反應可通過添加等體積的 0.75 M NaOH 終止）。
6. HRP 顯色液
HRP 的底物為過氧化氫。過氧化氫的裂解與氫供體的氧化偶聯，反應期間氫供體的氧化使顏色發生變化。
7. TMB (3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)
將 TMB 溶液添加到每個孔，孵育 15-30 分鐘，添加等體積的終止液 (2 M H2SO4)，然后在 450 nm 處讀取光密度。
8. OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)
在 492 nm 下測定終產物。注意底物對光敏感，應將它存放在暗處。
9. ABTS (2,2’-聯氮-雙-[3-乙基]-苯并噻唑啉-6-磺酸) 二銨鹽
終產物為綠色，可在 416 nm 處測定光密度。注意：某些酶底物被認為是有害的（潛在致癌物），因此始終要小心處理并佩戴手套。
1) 使用多道移液器或多檔移液器為每孔分配 100 μl（或 50 μl）底物溶液。
2) 待顯色充分后（如有必要），將 100 μl 終止液添加到微孔。
3) 用酶標儀讀取每孔的吸光度（光密度）。
10. 數據分析
由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線，濃度標在 X 軸（對數標度）上，而吸光度標在 Y 軸（線性標度）上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。