結腸直腸腫瘤細胞的培養

用于傳代培養的Dispase

生長培養液 洗液 消化液

培養瓶

一、酶消化

1. 用洗液（洗液：添加 5% FBS、200 U/ml 青霉素、200 ug/ml 鏈霉素和 50 ug/ml 慶大霉素。在原代培養時，慶大霉素的作用至少維持一周，然后除去。）清洗腫瘤標本 4 次。

2. 將組織塊放入小量洗液中，洗液恰好浸沒組織塊（避免組織干）。用交叉的手術刀片或鋒利手術剪將組織塊剖成約 1 mm³ 小塊。

3. 通過用臺式離心機離心（300 g，3 min），將組織塊清洗 4 次。清洗次數以經驗而定，并根據細胞污染情況。

4. 將組織塊放入消化液（消化液：DMEM，添加的抗菌素同洗液，并添加 1.5 mg/ml 膠原蛋白酶（ IV型，Worthington）、0.25 mg/ml 透明質酸酶（ I 型，Sigma）和 2.5%~5% FBS。盡管常用 Worthington 公司生產的膠原蛋白酶，也可試用 Sigma 公司生產的培養級別的膠原蛋白酶。），在 37℃ 條件下搖晃，通常過夜（約 12~16 h )。由于消化是一個緩慢過程，組織塊在消化液中的時間多少并不要緊，重要的是在此過程中不讓消化液變為酸性。低 pH 說明組織塊在消化液中的時間過長或放入消化液中的組織塊過多。將約 1 cm³ 腫瘤組織放入 20~40 ml 消化液。

二、非酶消化

腺瘤總是需要用酶消化。然而，常發現在用手術刀片將癌組織切成 1 mm³ 、時小的細胞簇從腫瘤組織脫落入洗液中。在這種情況，可按下列步驟操作。

1. 收集含有脫落細胞簇的洗液。

2. 將離心管放置幾分鐘，通過重力使細胞簇沉降，將組織塊與小的細胞簇分開。

3. 吸出上清液。

4. 直接培養剩下組織塊，或者將組織塊放入洗液內，輕輕搖晃 30~60 min，以便使更多的小細胞簇脫落下來，然后收集細胞簇，種植于培養皿內，與剩余的組織塊分開培養。

5. 在種植于培養皿內之前，將所有標本洗 3 次。

三、原代培養的標準條件

1. 在預涂膠原蛋白和種植飼養細胞的 25 cm² 培養瓶，用 4 ml 培養液培養從腫瘤組織分離的上皮性小管和細胞簇。

2. 在含有 5% CO₂ 和 37 ℃ 的培養箱內培養。

3 . 每周換培養液兩次。

小管和細胞在 1~2 d 內開始附著底物，上皮細胞遷移出來。大多數小管和小的上皮塊在 7 d 內貼壁，但大的類器官物需要 6 周才能貼壁，盡管貼壁時間有所變化。

如果將細胞接種于預涂膠原蛋白的培養瓶（Biocoat，B-D Biosciences），在原代培養過程中上皮容易貼壁。與無 3T3 詞養層相比，將細胞接種于 3T3 飼養層上時細胞生長非常好。當上皮細胞克隆擴增至每個克隆有幾百個細胞時，它們變得不依賴于 3T3 飼養層，故不必再加入詞養層細胞。

四、繼代培養和擴增

不能用常規的胰蛋白酶和 EDTA 混合液處理方法對大多數結腸直腸腺瘤的原代細胞和腺瘤細胞系進行傳代 [ Paraskeva et al.， 1984，1985 ]。由于用 0.1 % 胰蛋白酶（用 0.25 mmol/L EDTA 配制）將腺瘤細胞分散為單細胞導致細胞生長很差，故換用 Dispase。

1. 將 Dispase 液注于細胞單層上，恰好浸沒細胞（每個 25 cm² 培養瓶約 2.5 ml）。對原代細胞處理 40~60 min，而對細胞系處理 20~40 min。

2. 一旦上皮細胞層開始去附著（去附著的是細胞片，而不是單細胞），用吸管吹打，以促進去附著，使細胞片分散成細胞簇。

3. 在標準的培養條件下清洗和種植細胞。幾天后細胞簇去附著，故應輕輕換液。