均相光激化學發光免疫分析技術(amplified luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbent assay,AlphaLISA) 是一種以表面包被有親和涂層的受體微球(acceptor beads) 和供體微球(donor beads) 為載體的均相免疫學檢測技術。該技術靈敏度高、特異性強、背景影響低、樣品要求低、耗費少、分析操作簡單以及檢測范圍寬泛，既適用于傳統ELISA 和其他化學發光技術可以檢測的小分子簡單相互作用，更可以勝任大分子復雜相互作用的高通量檢測。
均相光激化學發光免疫分析技術(amplified luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbentassay, AlphaLISA) 是以生物分子間相互作用為原理，熒光共振能量轉移發光為基礎，以硅膠微球為載體，時間分辨熒光為檢測模式的免疫學研究技術。該技術起源于1994 年研究發現的單線態氧分子能量傳遞發光原理，并據此建立的光激化學發光技術(light initiated chemiluminescent assay,LICA)，光敏劑經激發光照射產生單線態氧，發光劑接受單線態氧能量傳遞產生熒光。1999 年，這一技術經Perkin Elmer 公司改進，將光敏劑、發光劑包被于涂布有親和涂層的硅膠微球表面，以此種微球作為免疫吸附的載體進行免疫學分析，從而誕生了AlphaLISA 技術。該技術以免洗滌、易于自動化和機械化的操作優勢，以高靈敏度特異性和高通量的技術特點，成為近幾年免疫研究分析的熱點，已廣泛應用于生物醫學研究，代表了現在及未來分析檢測技術的發展趨勢。
1 AlphaLISA技術原理
AlphaLISA主要利用分子間相互作用原理，如抗原抗體特異性相互作用，以硅膠微球為載體，當分子間存在相互作用而使得微球相互接近時，通過激發光激發，產生熒光檢測分子間相互作用。該技術采用表面化學處理硅膠微球，供體微球和受體微球表面包被有親和涂層，常見的如親和素、鏈親和素、ProteinA、ProteinG 等，可以結合待測生物分子，分子間相互作用會將供體和受體微球拉近至單線態氧擴散范圍以內，即200 nm 以內，從而激發級聯放大的化學發光反應。其發光原理為光激化學發光，供體微球表面涂布光敏劑苯二甲藍，受體微球表面涂布發光劑二甲噻吩衍生物并螯合有稀土原子銪。因而，當用680 nm 的激光照射時，供體微球表面光敏劑分解環境中的氧，形成單體氧分子( 氧自由基)，單體氧分子擴散到受體微球，將能量最終傳遞給稀土原子銪，激發波長為615 nm、半衰期為0.3 s的激發光，可以采用熒光掃描儀檢測( 圖1)。
2 AlphaLISA技術特點
AlphaLISA具有高通量、分析操作簡便、穩定性強、背景影響低、對樣品要求低、樣品消耗少、靈敏度特異性高和檢測范圍寬泛等特點，是進行科學研究通用平臺建設的良好選擇。
2.1 高通量、節約樣品、操作簡便
AlphaLISA微球足夠小，直徑為188 nm，實驗時經混勻不會自然沉淀或堵塞移液頭，使自動化液體處理非常容易，適合進行高通量儀器掃描檢測實驗；同時，微球也足夠大，有足夠的沉降系數，因此，整個偶聯過程不需親和柱純化，只需要離心就可將偶聯蛋白和未偶聯蛋白分離。整個AlphaLISA 檢測過程可控制在2 h 以內，而ELISA普遍需要至少4 h，其簡單的操作適合機械自動化操作。目前，結合配套耗材有96 孔、384 孔、1 536孔及3 456 孔方式的檢測，靈敏度不受影響，并且不需調整試劑濃度。檢測體積為50 μL，根據實驗需要可減少到10 μL、5 μL，乃至2 μL，達到節約成本的目的，微量檢測非常適用于大量樣品高通量檢測，適合稀有樣品檢測。Foo 等利用AlphaLISA 技術檢測唾液中NT-ProBNP 含量，僅耗費了1 μL 唾液，相當于ELISA 五分之一的樣品，靈敏度可達到16 pg/mL，為ELISA 檢測的15 倍，總檢測時間僅1.5 h。Liu 等建立了AlphaLISA 檢測乙肝表面抗原技術，靈敏度0.01 IU /mL，線性范圍0.04 IU/mL 至 100 IU/mL，總耗時僅0.5 h。Dynon等采用此技術檢測孕中早期(13~14 周) 血清先兆子癇標記物HtrA3 濃度，可在1.5 h 內快速區分健康和高危人群，幫助臨床及時采取治療措施。Edwards 等改進組蛋白H3 (1~21 殘基) 甲基化檢測方法，采用AlphaLISA 技術代替原有均相時間分辨熒光技術(HTRF)，樣品消耗從10 μL 減少到1 μL，同時減少了耗材和樣品的耗費，將檢測成本從8 000$/10 000 孔降低到600$/10 000 孔。AlphaLISA各組分經過孵育后無需洗滌、顯色等步驟，可直接掃描檢測，優化后的AlphaLISA 檢測系統可以極大程度地節約時間和人工，適用于臨床高通量檢測篩選。
2.2穩定性強
AlphaLISA檢測體系具有良好的穩定性，由于其接近發光效應取決于單分子氧能量傳遞，而光敏劑和發光劑并不產生損耗，在一定時間內可重復檢測，結果穩定。Zhang 等研究人體唾液纖溶酶原激活物抑制劑1 (PAI-1) 的濃度，分別于上午9 點，下午16 點采集唾液和血液進行檢測，實驗批間變異系數8.59%，批內變異系數7.52%，皆符合統計學標準，唾液PAI-1 的中位數濃度在上午為394μg/mL (243.4~833.1 μg/mL)，下午為376 pg/mL (129.1~615.4 pg/mL)，血漿濃度為59 000 pg/mL (24 000~110 000 pg/mL)。唾液PAI-1 濃度與血漿不相關(P =0.812)。研究人員試驗將研發的乙肝表面抗原AlphaLISA 檢測試劑盒放置4°C 半年或37°C 7 天，試劑盒檢測信號變化不大，標準曲線穩定，標準品質控點信號無明顯升高。Dudal 等對現有免疫學研究手段檢測性能的研究表明，AlphaLISA體系穩定性更強，檢測系統標準曲線穩定達一年以上。這一特性使得AlphaLISA 技術方便體系優化、條件優化或改變反應配對進行優化，檢測平臺建立后可長期使用，而解離增強鑭系元素熒光免疫檢測(DELFIA) 每6 個月至一年需要對檢測試劑進行重新評估。
2.3背景影響低、樣品要求低
本技術接受680 nm 激發光，發射615 nm 發射光，激發光與發射光波長差異大，因此背景熒光影響很小。615 nm 的發射光波長與血清及組織提取液等樣本中其他物質的發射峰均不相同，因此避免了如血紅蛋白、膽紅素等雜質對檢測信號的干擾，并最大程度降低了檢測信號的背景值，因此對樣品要求低；而供體微球表面的高密度光敏劑，可使每個微珠每秒產生上萬個單線態氧( 氧自由基)，級聯放大信號值，從而使檢測靈敏度達到埃摩級水平；AlphaLISA 采用特定的680 nm 激發光激發級聯放大化學發光反應，該反應的半衰期為0.3 秒，可使用時間分辨的方法檢測。時間分辨熒光模式，即同時檢測熒光信號值和時間兩種數據，由于稀土原子銪激發光半衰期長達0.3 秒，遠長于血紅蛋白等干擾物質的發光時間，因此延遲檢測可有效規避背景熒光，進一步降低了背景，提高了掃描信號的信噪比，確保了結果的真實性，是進行復雜樣品檢測的理想選擇，如血清和血漿、全細胞裂解物、唾液和組織提取物等。此技術降低背景影響的同時提高了靈敏度和線性范圍，同時對樣品要求低，可直接檢測體液中的生物分子，只用很少的樣品即可得到精確結果，因此可進行稀有樣品的檢測。
2.4 靈敏度高、檢測范圍寬泛
AlphaLISA的靈敏度可達亞摩爾(10?17) 水平。激發光照射時，每個供體微球每秒鐘可以產生60 000 個單體氧，單個受體微球可結合200~300 個抗體，基于微球的均相反應體系提高了反應比表面積，大幅度增強了反應靈敏度，在有些生物分析中甚至可以檢測低至10?18 mol 的樣品。由于背景低、抗淬滅能力強，AlphaLISA 技術具有非常寬泛的線性范圍，可以檢測親和力從“sub-nmol/L”(10?18)到μmol/L 級范圍內的相互作用。
單分子氧的半衰期為4 微秒，擴散距離為200nm。Alpha 供體微球和受體微球在小于200 nm 的范圍內都可被檢測到，因此，不光可以檢測常規的小分子相互作用，如抗原抗體、配體、第二信使、細胞因子與受體間相互作用，更可以檢測完整蛋白質、酶復合體、噬菌體等相對分子質量巨大或非常復雜的復合物和相互作用。由于溶液中分子間遠大于此距離，在生物分子不存在特異的互相作用時，單體氧無法擴散到受體微球，則不會有信號的產生。也正是這200 nm 的單體氧擴散距離，使得AlphaLISA技術得以檢測更復雜的相互作用，也可比較檢測分子量相差懸殊的配體。而其他均相技術，例如時間分辨熒光共振能量轉移(TR-FRET)、熒光偏振(FP)，供體和受體之間的距離為10 nm，僅限于小分子的檢測。常慧等建立了大鼠血清仙臺病毒Alpha快速檢測平臺，與ELISA 試劑盒比較對40 例隨機大鼠樣品的檢測，檢出陽性率達20%，高于ELISA的17.5% 的檢出率，經IFA 驗證Alpha 平臺檢測結果為真陽性。
Chen 等開發了針對特定細胞表面抗原的免疫細胞篩選濾膜，在受體微球上結合特異抗體，AlphaLISA 能快速、靈敏地直接檢測從微量的血液樣本中分離的CD14+ 細胞，每分鐘可以分離20 ml血液樣本，高達70% 的捕獲率和97% 的準確率。Szekeres 等分別于細胞裂解物和組織裂解物中比較使用AlphaLISA 技術、均相時間分辨熒光(HTRF)技術和ELISA 檢測老年癡呆( 阿爾茨海默癥) 的生物標志物Aβ1-40 和Aβ1-42 的含量，結果顯示ELISA檢出限為125 pg/mL，HTRF 約為22 pg/mL，而AlphaLISA 可檢出低于2 pg/mL 水平的待測物質，最為靈敏。Tian 等用AlphaLISA 檢測人血清HBsAg水平，其最低有效檢測濃度為0.01 U/mL，線性范圍0.04~100 U/mL。TR-FRET ( 時間分辨免疫熒光) 和AlphaLISA 都是靈敏、特異、高效的均相時間分辨熒光檢測手段，而TR-FRET 對樣品要求較高，檢測線性范圍也不及AlphaLISA 寬泛。賀安比較酶聯免疫分析(ELISA)、化學發光免疫分析(CLIA)、電化學發光免疫分析(ECLIA) 和時間分辨熒光免疫分析(TRFIA) 與其實驗室開發的AlphaLISA 技術對癌胚抗原檢測性能，其中AlphaLISA 檢測下限可達到0.11 ng/mL，高于商品化的ELISA、CLIA、ECLIA數個數量級，檢測范圍寬泛(0~600 ng)。雖然TRFIA在靈敏度上與AlphaLISA 相似，但樣本消耗量多10 倍。除AlphaLISA 外，其他檢測方法皆需要洗滌步驟來除去未結合的分子。Qian 等比較AlphaLISA、DELFIA、LanthaScreen 對細胞的組蛋白H3 的Lys27 三甲基化(H3K27me3) 檢測性能，其中AlphaLISA 在2 500 個細胞水平可檢出明顯差異，經Western 驗證無假陽性結果，LanthaScreen與DELFIA 在5 000~20 000 個細胞水平檢測出甲基化差異，樣品耗費大于Alpha 技術。AlphaLISA 檢測樣本范圍更寬，達到3~5 個數量級，樣本消耗更少，因此也更為經濟。
AlphaLISA技術結合了表面化學、免疫學、激光技術、氧自由基能量傳遞、均相反應技術等優點，相較其他免疫分析技術有突出的優勢( 表1)。
3AlphaLISA在生物學、生物醫學檢測中的應用進展
AlphaLISA已經被成功地應用于酶功能檢測，生物分子包括受體與配體、蛋白質與蛋白質、蛋白質與核酸等的相互作用檢測，免疫檢測和G 蛋白偶聯受體功能檢測(cAMP，IP3) 等熱點領域。受體微球可以與一抗偶聯，也可以利用物種特異性的二抗偶聯的受體微球或ProteinA ( 重組純化蛋白A)、ProteinG ( 重組純化蛋白G) 和抗融合蛋白偶聯的受體微球。受體微球也可以與特定的結合蛋白偶聯，在生物醫學領域有著廣泛的應用現狀和前景。反轉錄病毒激活蛋白(Tat) 在人類免疫缺陷型病毒1 (HIV-1) 的復制中起重要作用。它募集宿主轉錄延伸因子(pTEFb) 與RNA 聚合酶II，使得HIV-1 病毒RNA 復制延伸。阻斷Tat 和pTEFb 相互作用為抗病毒治療提供了新思路。Burlein 等使用His標記pTEFb和生物素化的Tat，利用AlphaLISA監測Tat 和pTEFb 之間的相互作用，采用競爭法測定了未標記的pTEFb。該測定的Z 值大于0.5，說明AlphaLISA 是簡單快速、強勁的高通量篩查手段。該測定的發展可以促進一類新的抗病毒劑HIV-1 的發現，為患者提供更寬泛的治療選擇。Tian 等建立AlphaLISA 檢測平臺研究乙肝表面抗原，利用單克隆抗體篩選乙肝抗原主要亞型(ADR 和AY) 以確認平臺對于突變體的敏感性。檢測線性范圍在0.04~100 U/mL，檢測最低限可達0.01 U/mL，與ELISA 以及商品化學發光試劑盒相比，結果相關系數為0.91，且更為敏感且快速，是乙肝表面抗原檢測的理想體系。林冠峰等利用光激化學發光免疫分析法建立人促卵泡激素hFSH 的快速檢測平臺，分析敏感性和功能敏感性分別為0.09 和0.12 U/L，線性測量范圍為0.09~192 U/L，試劑的分析內變異系數(CV) 和分析間CV 分別為4.2%~7.1% 和7.5%~8.3%，均<10% ；檢測100 份臨床血清樣本，本試劑檢測結果與商用化學發光試劑盒檢測結果相關系數為0.979。Poulsen 等用ELISA 和AlphaLISA比較檢測人血清中胰島素水平，證實AlphaLISA 技術具有明顯高的靈敏度，對血清的需求量只有ELISA的五分之一，靈敏度卻是后者的15 倍。
AlphaLISA技術顯示了高靈敏度和適應復雜樣品的優異特性。乳糜瀉患者可根據血清標志物脫酰胺醇溶蛋白肽(DGP) 診斷，重組全人源化單克隆抗體(hmAb) 是由分離自患者的漿細胞分泌的抗麥膠蛋白IgA 抗體。Steinsb 等利用重組人抗麥膠蛋白多肽單克隆抗體hmAb 1002-1E03 對患者和健康人群血清DGP 進行抑制性實驗，檢測患者和對照組血清DGP 抗體水平，選用的檢測抗原是ω- 醇溶蛋白和低相對分子質量谷蛋白中分離的34aa 和26aa 的肽段。此AlphaLISA 檢測系統具有86.8%的靈敏度和98.6% 的特異性，優于常規的商品化試劑盒且方便快捷，已成為臨床診斷的重要參考檢測。人血液中20% 的蛋白質成分可在唾液中找到，唾液作為診斷樣本，有非入侵性、簡便安全的特點。Foo 等利用雙抗夾心法AlphaLISA 技術檢測健康人群(40 例) 及心衰患者(45 例) 唾液NT-proBNP水平，并分析其與血液NT-proBNP 的相關性，結果顯示唾液的NT-proBNP 水平在健康人和心衰患者間存在明顯差異，中位數分別為16 pg/mL 和76.8 pg/mL。免疫測定顯示82.2% 的臨床靈敏度和100% 的特異性，100% 陽性預測值和83.3% 的陰性預測值，以及90.6% 的總診斷的準確性。唾液與血液樣品檢測相關性R2 = 0.78 (p = 0.01，y=1.7056 + 1910.8)。Zhang 等研究唾液中心血管疾病指示物纖溶酶原激活物抑制劑-1 (PAI-1) 水平，早晨和晚上唾液纖溶酶原激活物抑制劑-1 (PAI-1) 中位數分別為394pg 和378 pg，證明唾液取樣時間不影響檢測結果，而血液中此蛋白含量早晚有明顯差異。
腫瘤標志物是腫瘤診斷，尤其是早期診斷的重要檢測指標，AlphaLISA 技術因其靈敏、快速、高通量的特點，促進了腫瘤標志物檢測的發展。cyfra21-1 是細胞角蛋白19 的可溶性片段，目前主要用作腫瘤標志物，對肺癌的診斷有較大意義。He等建立檢測血清cyfra21-1 水平的AlphaLISA 平臺，靈敏度達0.08 ng/ml，檢測范圍涵蓋0.08~500ng/ml，與商用ECLIA 法檢測相關系數達0.97 以上，且無需洗滌。 Yakubov 等建立AlphaLISA 研究平臺，研究His 標簽的TG2 與生物素化FN 片段相互作用( 兩者分別通過標簽結合于受體微球和供體微球)，期待找到影響這一復合體結合的小分子。經過對10 000 種小分子化合物的篩選，從中選擇對TG2-HF 復合體有70% 以上抑制作用的小分子。后續測定其對卵巢癌細胞黏附、遷移和增殖能力的影響，最終篩選出TG53 作為TG2-HF 復合體形成的抑制劑，并進行后續研究。添加10 μmol/L 的TG53可以顯著抑制細胞劃痕修復，TG53 有望成為卵巢癌種植性轉移(transcoelomic metastasis) 的抑制劑。Leister 等聯用AlphaLISA和HTRF 技術，分析了THP-1 細胞中各種潛在配體和TNFα 的相互作用，在1 280 種小分子化合物中發現了幾種新的TNFα抑制劑，其中AlphaLISA 采用1536 孔板，樣品消耗量小，檢測下限(LDL) 為3.6 pg/mL，動態范圍為3.6~30 000 pg/mL，比起傳統的ELISA 在靈敏度和數據通量方面有明顯優勢。HuR 在多種類型的癌癥中呈高豐度表達，通過與癌癥相關mRNA 相互作用，促進癌基因表達。Wu 等[26] 從6 000 個小分子抑制劑中，用AlphaLISA 技術篩選出對HuR 與mRNA 相互作用抑制效果最高的HuR-ARE，為HuR 高表達型癌癥的靶向治療提供了新途徑。
AlphaLISA技術平臺可與其他技術平臺結合使用，提高研究或診斷性能。Schneider 等結合AlphaLISA 與串聯泛素結合實體(TUBEs) 分析技術研究Mdm2 活性，該技術可用于尋找潛在的Mdm2抑制劑。此技術平臺可應用到Hrd1、TRAF6 和Smurf1 E3 連接酶的活力測定，因此有普遍適用于其他E3 連接酶的潛力。Zeta 等并聯AlphaLISA技術與高度集成微流體技術，檢測血清樣本中TNFα 水平，與現成的ELISA 檢測平臺比較，靈敏度提高到10 pg/mL，時間縮短至45 分鐘內，同時檢測8 個樣品，建立了快速、自動、平行定量免疫學研究平臺。
AlphaLISA檢測技術具有高度的敏感性、均一性和寬泛的檢測范圍，操作簡便，樣本需求量低，減少了總檢測時間的同時提高了檢測的效率。同時，它有效回避了樣品熒光干擾，對待測樣本質量需求低，易于優化檢測體系，真正實現了檢測的均一性。未來隨著工藝的改進，成本將不斷降低，且此技術的高通量特性使得大規模樣本檢測中，單一樣品檢測成本得以壓縮。疾病的生物標記物，尤其是腫瘤標記物的研究發展需要高靈敏度、高通量、易于自動化的檢測平臺，有利于在疾病初期及時診斷并實施干預。和許多新技術一樣， AlphaLISA 檢測還存在試劑、儀器成本較高的問題，需要技術突破來解決；其研究和應用還不夠成熟，目前針對臨床常用檢測指標分子的AlphaLISA 檢測試劑盒還很少。但近年來越來越多的研究成果表明，AlphaLISA 檢測技術平臺必將成為基礎醫學研究、疾病診斷、轉化醫學等多領域研究的得力手段。