克隆成功與否,除與連接方式以及載體選擇有關外，載體的處理也是一個重要環節。為了提高連接效率，處理載體時應注意以下幾點：
(1)應加入常用量5～10倍的內切酶水解載體，以保證載體被完全酶切；
(2)如用雙酶切割載體，則必須電泳回收載體片段，除去雙酶切所產生的小DNA片段； (3)如粘端連接,單酶切處理過的載體必須用
堿性磷酸酶(如牛小腸堿性磷酸酶，CIP)處理，防止載體自身環化。CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸。對于3末端突出的DNA(如
〖ＷＴ５ＢＸ〗Pst〖ＷＴ５ＢＺ〗I水解，需用10倍于5末端突出DNA(如〖ＷＴ５ＢＸ〗Eco〖ＷＴ５ＢＺ〗RI,〖ＷＴ５ＢＸ〗
Hin〖ＷＴ５ＢＺ〗dⅢ)的CIP進行去磷酸化，以達到最少的載體自身環化。
去磷酸方法如下：
①DNA加入10倍去磷酸化緩沖液，5端突出的DNA，每100pmol 5磷酸基團加入1個單位的CIP，37℃反應30分鐘。平末端或3端突出的
DNA，每2pmol 5磷酸基團加1個單位CIP，37℃保溫15分鐘后，再加CIP，55℃反應45分鐘(2μg 5kb的線性DNA約含14pmol左右的5磷
酸基團)；
②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分別至終濃度05%、 5mmol/L和50μg/ml，混勻后56℃反應30分鐘；或加EDTA(pH8.0)至終濃度為5mmol/L，65℃保溫1小時或75℃，10分鐘滅活CIP;③冷卻至室溫后，加入等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次; ④乙醇沉淀，離心，抽干，溶于無菌去離子水，濃度最好為100μg/ml,-20℃保存備用。〖ＨＴ５Ｈ〗 10倍CIP去磷酸化緩沖液：〖ＨＴ〗〖JZ(Z〗10 mmol/L ZnCl210 mmol/L MgCl 2100 mmol/L Tris·HCl,pH8.0。