可在微量細胞中鑒定RBP作用靶點的新技術LACEseq被開發

　　人類基因組編碼了約1500個RNA結合蛋白（RNA-binding protein, RBP），它們往往通過結合RNA分子上的特定基序或結構元件而調控細胞內各種RNA分子的加工、定位、翻譯和穩定性等。RBP在早期生殖、個體發育、細胞分化、增殖和凋亡等幾乎所有的生理過程中都發揮了關鍵的調控作用。RNA結合蛋白的突變會導致多種遺傳性疾病。比如，FUS和TDP43的突變可導致肌肉萎縮性側索硬化癥，而U2AF35、SF3B1等的突變會導致骨髓增生異常綜合癥的發生。準確鑒定RBP的結合靶標及精確結合位置是理解其生理和病理調控機制的前提。

　　目前常用的鑒定RBP靶標的方法主要有RIP-seq和CLIP-seq。由于這兩種方法都依賴于利用特異性抗體富集RBP及其所結合的RNA，而且需要百萬數量級的細胞，因此嚴重限制了這些方法在稀有細胞類型及臨床穿刺樣本中的應用。比如，RBP在早期生殖和胚胎發育過程中發揮著關鍵調控作用，但是由于缺乏可在微量細胞甚至單細胞水平研究RBP靶標的實驗方法，導致早期生殖過程中RBP及其復合物的分子機制研究依然是個空白。

　　2021年6月9日9，中國科學院生物物理研究所薛愿超研究員，及廣東省第二人民醫院孫青原教授、北京大學黃超蘭教授作為共同通訊作者，在 Nature Cell Biology 期刊發表了題為：Global profiling of RNA-binding protein target sites by LACE-seq 的技術報告論文。

　　研究團隊開發了可在微量細胞中鑒定RBP作用靶點的新技術LACE-seq（Linear amplification of cDNA ends and sequencing）。通過線性擴增逆轉錄酶在RBP結合位點處的終止信號，首次實現了在單堿基分辨率和單細胞層面精準鑒定RBP的結合位點，為研究RBP在胚胎發育和生殖疾病中的功能機制打開了大門。

　　利用創建的LACE-seq方法，研究團隊取得如下研究成果：

　　1）首次在卵細胞中繪制了Ddx4、Ptbp1、Ago2和Mili等RBP的具體靶標和結合位置；

　　2）率先發現Ago2/endo-siRNA沉默復合物在卵細胞中以非完全互補配對的方式抑制mRNA的翻譯，并證明endo-siRNA的靶標Bub3、Chk1、Nuf2等的蛋白質水平變化可能與Ago2敲除后的表型相關；

　　3）證明了Ago2/endo-siRNA復合物可切割由逆轉座子（Long-terminal repeat retrotransposons）啟動子起始的嵌合體RNA，該機制確保了卵細胞中轉錄組的完整性。

　　LACE-seq方法可在微量細胞中準確鑒定PTBP1的結合靶標

　　據悉，中科院生物物理所博士研究生蘇瑞寶、生物物理所副研究員曹唱唱、動物所博士研究生樊立華為論文共同第一作者；生物物理所薛愿超研究員、動物所及廣東省第二人民醫院孫青原教授、北京大學及北大-清華生命科學聯合中心黃超蘭教授為論文共同通訊作者。該項工作得到了科技部重點研發計劃、國家自然科學基金委和中科院先導項目等多項基金資助。