ISPCR擴增的產物的雜交和檢測實驗

探針

SSCSDS顯影液定影液蘇木精PBSAEC封阻液NaClTris·Cl二甲基甲酰胺BCIPNBT乙醇

培養箱蓋玻片載玻片干燥劑加濕盒

1.  配如下雜交混合液

（1）2 μl 200 pmol/l 探針（終濃度4 pmol/l）

（2）50 μl 去離子的甲酰胺（終濃度50%）

（3）10 μl 20×SSC（終濃度2×）

（4）10 μl 100×Denhardt 溶液（終濃度10×）

（5）10 μl 10 mg/ml 經超聲處理的鮭精DNA（終濃度1 mg/ml）

（6）1 μl 10%SDS（終濃度1%）

（7）7 μl 水

2.  加10 μl 雜交混合液于載玻片各樣品孔中，樣品孔中含有經原位PCR擴增的核酸。再于各孔上蓋以蓋玻片，放95℃加熱塊上加熱5 min。

3.  載玻片放加濕盒中，于48℃溫育2~4 h。

如用³³P-標記探針：
 

4a.  移去蓋玻片，在2×SSC中洗片5 min。

5a.  將載玻片浸于稀釋的Kodak乳膠中。

6a.  晾干，然后在有干燥劑的閉光玻片盒中，放3~10天。

7a.  在暗室中，按下列程序對載玻片顯影：

（1）依次浸于Kodak顯影液，3 min

（2）水，30 s
 

（3）Kodak Unifix 定影液，3 min

8a.  在室溫下，2%Gills 蘇木精染液中，溫育2~3 min，對玻片進行復染。

如用通過過氧化物酶檢測的生物素或地高辛標記探針：

4b.  移去蓋玻片，在PBS中洗片2次，每次浸洗5 min。

5b.  加10 μl 100 μg/ml 的鏈親和素-過氧化物酶溶液于載玻片各孔中，輕輕蓋上蓋玻片，置37℃溫育1 h。

6b.  移去蓋玻片，在PBS中洗片2次，每次浸冼5 min。

7b.  在暗處，加100 μl AEC工作液于載玻片各孔，37℃溫育10 min，然后鏡下觀察，如顏色不夠強，再延長顯色10 min。

8b.  以自來水浸冼玻片，然后晾干。

如用通過堿性磷酸酶檢測的生物素或地高辛標記探針：

4c.  移去蓋玻片，室溫下，在2×SSC中冼片2次，每次浸洗15 min。然后加100 μl 封阻液于樣品孔中，覆蓋各孔表面，平放玻片于加濕盒中，室溫下溫育15 min。

5c.  對每一待顯色孔，用10 μl 40 μg/ml 鏈親和素-磷性磷酸酶結合物與90 μl 結合物稀釋緩沖液混合。

6c.  用吸水紙接觸載玻片邊緣、吸去封阻液，每孔中加100 μl 按上步稀釋好的結合物溶液，平放玻片于加濕盒中，室溫下溫育15 min。

7c.  于室溫下，100 mmol/l Tris·Cl pH7.5/150 mmol/l NaCl中洗片2次，每次15 min，然后，于室溫下，再以堿性磷酸酶底物緩沖液，洗片1次（5 min）。

8c.  在Coplin 廣口瓶中預熱50 ml 堿性磷酸酶底物緩沖液至加37℃，加200 μl 75 mg/ml NBT和166 μl 的50 mg/ml BCIP充分混合。然后，將玻片放此液中置37℃溫育，直至達到所期望的顯色程度。（通常需10 min~2 h，可間歇性地從溶液中取出玻片，在10×物鏡下觀察顯色程度，但勿使玻片干涸）然后，將玻片浸于去離子水中終止反應，其間換水數次。

9.  室溫下，以0.2% Gills 蘇木精（如用于過氧化物酶的顯色）或1%核酸固紅染液（如用基于堿性磷酸酶的顯色）染片5 min，浸玻片于自來水中，換水數次。

10.  室溫下，依次將玻片置于50%、70%、90%和100%乙醇中，分別溫育1 min 進行脫水， 然后晾干。

11.  毎孔加1滴固片介質，壓上蓋玻片，立刻進行結果觀察（小心勿動蓋玻片），或放室溫過夜，使壓片介質干燥。
 

圖一、原位反轉錄/聚合酶鏈式反應。


圖二、HIV-1感染的微管內皮細胞系的DNA-ISPCR。