mESCs二倍體胚胎嵌合

實驗概要

mESCs二倍體胚胎嵌合

主要試劑

孕馬血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）、H-CZB、人絨毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，hCG）

實驗材料

注射器、手術剪、手術鑷、35 mm培養皿、15 mL離心管、持卵針、體視顯微鏡、顯微操作儀、電融合儀

實驗步驟

（1）制備假孕鼠
下午挑取自然發情雌鼠，與結扎雄鼠合籠交配；在第二天檢陰栓，檢出陰栓的雌鼠記為交配后0.5 dpc，2.5 dpc假孕鼠的子宮就可以用做受體，進行胚胎移植。
（2）胚胎準備
①超數排卵【在動物發情的適當時期，利用外源促性腺激素類藥物調節雌性動物體內的激素水平，促進卵巢的多個卵泡發育，并能排出超過正常數量的卵子的方法，稱為促排卵，也稱超數排卵，簡稱“超排”】。選取8～12周齡的雌性小鼠，約5：00 PM注射PMSG（10U/只），48小時后注射hCG（10U/只）。
②雌雄小鼠合籠：將超數排卵的雌鼠與雄鼠合籠，第二天早上檢查陰栓，檢出有陰栓的雌鼠記為0.5 dpc，繼續飼養，3天后至3.5 dpc。
③沖胚：斷頸處死雌鼠，取完整子宮部分，用吸滿H-CZB的鈍針頭沖子宮內腔，將沖出來的囊胚收集起來，放于CZB中培養，待用。
（3）顯微操作
用持卵針固定好二倍體囊胚，固定靠近ICM部分，使ICM部分大約固定在9點鐘位置上。用平口注射針吸取約10個供體細胞，從約3點鐘位置進針，抵住受體囊胚透明帶以及滋養層細胞與細胞間的連接處，用Piezo給電脈沖（100 V/mm，50 μs），使注射針進入囊胚腔，將供體細胞吹到靠近ICM的囊胚腔中。
（4）胚胎移植
①顯微操作完成的胚胎，放在含葡萄糖的CZB培養液中培養1～2 h，待囊胚腔重新膨脹起來后進行胚胎移植。
②將2.5 dpc假孕鼠麻醉后，進行手術，將擴展的囊胚移入子宮角內，每側子宮移植10～12個胚胎。
③手術后的小鼠送回鼠房飼養，待17天后，即假孕鼠的19.5 dpc觀察嵌合鼠的出生結果。mESCs二倍體嵌合動物（供體細胞來自于C57BL/6品系，受體胚胎來自于ICR品系）如圖3-8所示，黑色與白色嵌合的小鼠為二倍體嵌合鼠。
！注意：顯微注射必須在細胞準備后的2 h內完成，推遲顯微注射太長時間會嚴重影響二倍體嵌合的效率。