mRNA的純化

實驗概要

本文介紹了mRNA的純化方法。

實驗原理

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA  3‘末端含有Poly（A  ）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。

主要試劑

1. 3M醋酸鈉（pH 5.2）

2. 0.1M NaOH

3. 1×上樣緩沖液：20mM  Tris-HCl（pH 7.6）；0.5M NaCl;1M EDTA（pH  8.0）；0.1%SLS（十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl（pH 7.6）、NaCl、EDTA（pH  8.0）的母液，經高壓消毒后按各成分確切含量，經混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%

4. 洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl（pH 7.6）；1mM EDTA（pH 8.0）；0.05% SDS

5. 無水乙醇、70%乙醇

6. DEPC

主要設備

1. 1ml注射器

2. 65℃水浴鍋

3. 紫外分光光度計

4. 高速離心機

實驗材料

已提取好的RNA。

實驗步驟

1. 將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。

2. 用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml,用3倍柱床體積的DEPC H₂O洗柱。

3. 使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。

4. 將RNA溶解于DEPC H₂O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續收集流出液。

5. 將所有流出液于65℃加熱5min,冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。

6. 用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內含物為無Poly（A）尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。

7. 用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly（A ）RNA,分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。

8. OD260測定Poly（A ）RNA分布，合并含Poly（A ）RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min.

9. 4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly（A ）RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。

10. 用適量的DEPC H₂O溶解RNA。

注意事項

1. 整個實驗過程必須防止Rnase的污染。

2.  步驟4中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly（A  ）尾處的二級結構，使Poly（A ）尾充分暴露，從而提高Poly（A  ）RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。

3. 十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。

4. 寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH₂O、上樣緩沖液洗柱。

5. 一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly（A ）RNA,約相當于上柱總RNA量的1%-2%。