實驗概要
本實驗方法介紹了miPS建系的詳細操作流程。
主要試劑
所用試劑盒：
逆轉錄病毒體系試劑盒 MIPD0-000-001
慢病毒體系試劑盒 MIPD-000-02
規格：5次
組分名稱 | 貨號 | 規格 | 數量 |
逆轉錄病毒體系/慢病毒體系 | 20ul/支 | 5支 | |
助轉因子 | 10ul | 1支 | |
小鼠iPS細胞完全培養基kit A（含血清） | 200ml/瓶 | 1瓶 | |
小鼠iPS細胞建系培養基kit（無血清） | MIPD-001-100 | 100ml/瓶 | 1瓶 |
小鼠成纖維細胞 | 1x106/管 | 2管 | |
ICR飼養層細胞 | 1x106/管 | 10管 | |
成纖維細胞培養液 | 200ml/瓶 | 1瓶 | |
0.05%胰酶 | ET-001-100 | 100ml/瓶 | 1瓶 |
成纖維細胞凍存液 | MEFiM-001-50 | 50ml/瓶 | 1瓶 |
小鼠胚胎干細胞／iPS細胞凍存液 | MEFM-001-50 | 50ml/瓶 | 1瓶 |
0.1%明膠 | BMG-001-100 | 100ml/瓶 | 1瓶 |
PBS | BM-001-500 | 500ml/瓶 | 1瓶 |
實驗步驟
Day -1：接種 2×104細胞到每個24孔板的孔
Day 0：按MOI為5的病毒量把四個因子的病毒同時加到事先接種好的靶細胞里，同時加8ug/ml polybrene，成纖維細胞培養液不加sp。
Day 1：換液，從今天開始可以加sp的成纖維培養液。
Day 3：換液，觀察細胞。
Day 5：換液，觀察細胞，并準備飼養層。
Day 6：感染第六天的成纖維細胞這個時候細胞開始聚集在一起。如果感染效率比較高的話會出現小的克隆，此時可以用0.25%胰酶把細胞消化成單細胞接種到飼養層上，接種的密度是2*87.5px，仍然用靶細胞的培養液。
Day 7：棄去成纖維細胞培養液，換成miPS建系培養基。
Day 9：換miPS建系培養基，仔細觀察這個時候應該會開始出現小的克隆 。
Day 11 and Day 13：繼續換液并觀察克隆，這個時候克隆逐漸長大，重編程過程需要更多的營養，這個時候液體顏色容易變化，13d后細胞每天都必須進行換液，如果液體顏色在變黃的話，每個六孔板加3-4ml的液體。
Day 14：這個時候開始準備挑克隆，提前一天準備飼養層，選擇用24孔板進行第一次的克隆挑取，一般在挑克隆之前進行小鼠胚胎干細胞特異性的膜蛋白標志PE-SSEA-1的活細胞染色，SSEA-1陽性的克隆是完全重編程的克隆，一般情況是可以進行傳代穩定成系的克隆。
Day 15：成纖維種到飼養層后的第七天，飼養層細胞活力逐漸變小，有些開始凋亡，這個時候開始加條件培養液。
Day 17及其以后：挑取克隆后傳代及其鑒定。
注意事項
1. 目的細胞的質量要好，細胞代次低，狀態好。
2. 所使用病毒滴度要高。
3. 飼養層密度要比平常傳代時所使用的飼養層密度要密一點，而且最好選用新鮮的飼養層，而不選擇凍存復蘇的飼養層，新鮮的飼養層活力較強。
4. 飼養層狀態不太好后，要及時換成條件培養液。
5. 出現克隆后，可以進行活細胞染色，進行篩選。
6. 出現克隆后，要及時的挑出來，否則越養克隆狀態越差。