miRNA的特征、功能及識別方法等詳解（三）

2) miRNA的靶基因預測方法

miRNA的研究意義之重大是毋庸置疑的。然而，與新的miRNA的頻頻發現相比，miRNA的功能研究相對緩慢。到目前為止，在發現的4449多個miRNA中，確定功能的miRNA僅有幾十個。導致miRNA功能研究進展緩慢的非常重要的原因是miRNA的作用靶標難以確定。事實上，通過實驗方法確定miRNA的作用靶標非常耗時，目前尚無高通量的靶標鑒定方法。因此，通過理論方法預測miRNA的作用靶標成為當前識別miRNA作用靶標的較為理想的途徑。以下重點介紹幾種經典預測軟件的算法分析，其他軟件（表1.2）請查看相應網站

miRNA和siRNA的關系

miRNA和siRNA之間的關系令人迷惑。從表面上說，一個是非編碼的單鏈小分子RNA，在進化上高度保守，通過翻譯抑制調控基因表達而不影響轉錄本的穩定性；另一個是針對編碼區的雙鏈小分子RNA，每個轉錄本都可能有很多個siRNAs，是通過降解目標靶，在轉錄后調控基因表達。由于每個mRNA模版可能產生很多個siRNAs，要給每個siRNA定一個基因的名字就很困難。miRNA是進化進程中高度保守的，因此給直向同源物一個同樣的名字可能有助于了解他們的功能，而給另一個物種中一段無關的序列一個同樣的名字就容易造成混亂。

然而，據推測miRNAs通常是由較大的（70-90 nt）的莖環結構（發夾結構）前體經Dicer酶切割得到的，而Dicer同樣負責將長雙鏈RNA切割為siRNA，而且二者的長度也差不多，同樣有調控基因表達功能。因而這兩類小分子RNA之間的關系格外令人關注。

兩個廣為人知的miRNA——在線蟲中首次發現的lin-4 和let-7，可以通過部分互補結合到目的mRNA靶的3’非編碼區(3’UTRs)，通過一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制從而抑制蛋白質合成。這種結合并不誘導mRNA靶的降解，就是說作為翻譯抑制子本身不影響對應mRNA的豐度，其原因據推測是由于miRNA和結合位點之間不完全互補。這就區別于siRNA的介導的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以類似siRNA的方式介導目的RNA的降解。實驗表明引入和let-7目的mRNA靶完全互補的miRNA會誘導mRNA靶的降解。還有實驗結果表明一些miRNA，包括在植物中發現的Scarecrow miRNA，能結合完全互補的mRNA鏈從而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。這提示miRNAs可以和siRNAs一樣作用，這兩種小分子RNA作用通路可能有重疊的部分。這種重疊同樣提示siRNAs可能也有和miRNAs同樣的功能。

一個很有趣的實驗證實這個觀點：Doench和同事挑選一個已知在體內可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在熒光素酶報告基因的3’端插入對應的CXCR4結合位點——其中一個拷貝是插入一個完全匹配的CXCR4結合位點，另一個拷貝插入4個只有3’和5’端匹配，而中間不同的CXCR4結合位點，這樣選定的siRNA就不能完全結合到這個結合位點——中間形成一個突起的不匹配的環。將這兩個拷貝轉入Hela細胞并用siRNA誘導基因沉默。結果很有趣——兩個實驗都錄得熒光素酶活性下降了超過10倍，RT-PCR和Northern分析證實，第一個實驗的熒光素酶轉錄本下降了超過10倍，這正是正常的siRNA介導的RNAi反應，目標靶mRNA降解導致表達水平的下降，而第二個實驗中熒光素酶轉錄本僅僅下降1.2倍，這種目的基因表達水平下看起來象源于miRNA介導的翻譯抑制降，而不是siRNA介導的影響mRNA的穩定性導致。實驗表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。實驗人員還進行了另一個實驗：改變第二個實驗中的不匹配環的堿基序列看起來不影響抑制效果，但是siRNA和報告基因上的結合位點的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——這一點和siRNA抑制的情況一樣——唯一不同的是：完全匹配的結合位點（siRNA作用方式）可以單獨起作用而相互不影響，而增加不完全配對的結合位點（注意在第二個實驗中用了4個CXCR4結合位點）的個數對翻譯抑制有顯著的加乘作用。

在哺乳動物細胞中還沒有找到內源的siRNA，外源的siRNA介導的RNAi作用正是一種抵御機制。而miRNAs則廣泛存在于哺乳動物細胞中，從理論上推測可能參與多種調控作用。這兩種小東西的作用機制和相互關系的本質就顯得更加撲朔迷離。如何在實驗中正確鑒定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成為一個值得關注的問題。