miRcroRNA轉染流程

　　細胞轉染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。常規轉染技術可分為瞬時轉染和穩定轉染（永久轉染）兩大類。本實驗室主要是質粒轉染、miRcroRNA轉染、慢病毒轉染、藥物轉染、多肽轉染等。

　　一. 實驗材料及試劑

　　六孔板、CO2培養箱、EP管、酒精燈等；無血清培養基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine 2000、MSC細胞等。

　　二、實驗內容

　　1、當六孔板中MSC細胞密度達90％時，準備轉染，將無血清培養基、MEM-α或DMEM取出復溫并注意平衡好；

　　2、取出細胞，將培養基換成無血清培養基，放回孵箱培養；

　　3、取滅菌的EP管，按要求混好RNA（約100pmol/孔），每管250ul DMEM，混勻；

　　4、另取EP管，加入lipofectamine 2000（5 ul/孔）和MEM-α或DMEM（250ul/孔），輕輕混勻后室溫靜置5min；

　　5、將上述兩個EP管混勻；

　　6、室溫靜置20min，將lipofectamine 2000-質粒混合液滴到六孔板中，500ul/孔；

　　7、將細胞放回孵箱培養，4h后換回含血清的完全培養基。

　　三、注意事項

　　1、轉染的時候培養基中不能添加抗生素。抗生素，比如青霉素和鏈霉素，一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉染效率低。所以，在轉染培養基中不能使用抗生素。

　　2、如果在無血清條件下轉染，使用含血清的正常生長培養基進行細胞鋪板。在加入復合物前移去生長培養基，替換為0.5mL無血清培養基。

　　3、在37℃，5％的CO2中保溫24-48小時，無須去掉復合物或更換培養基或者在4-5小時后更換生長培養基也不會降低轉染活性。