評估RNA分離的需要，我們直接在miRNA的檢測中增加了細胞裂解物。相當于直接在7.5毫升逆轉錄反應中添加2.5-2500細胞。當檢測到，在一些細胞中CT值相關R2>0.998）的RT反應至少有三個數量級（圖4）。
圖3。總RNA輸入的閾值循環（CT）值檢測8個miRNA的相關性。每RT反應中，小鼠肺總RNA輸入范圍從0.025到250納克。將新桿狀線蟲的miRNA（MIR-2）列入作為陰性對照。
鼠或人的腦，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎（10-12天）的總RNA樣品均購自Ambion公司。根據標準曲線lin-4合成的miRNA對每個細胞拷貝數進行估計。每個RT反應中添加150ng的RNA（或相當于約10
000個細胞，假設每個細胞中有15pg總RNA）。依據TaqMan磷酸甘油醛脫氫酶的內對照（P / N4352339E）將RNA規范化輸入。
檢測了12組非特定的基因組DNA對TaqMan miRNA的影響。結果表明，RT反應中是否添加5納克人類基因組DNA對CT值沒有影響，表明RNA的目標（數據未顯示）檢測是非常特異的。基于這一觀察，我們直接miRNA定量檢測中增加了熱處理細胞。圖5顯示了使用純化總RNA，細胞裂解物，從同樣數目的HepG2細胞得到的熱處理細胞的miRNA進行定量比較。直接添加熱處理細胞的miRNA的檢測CT值最低，和其他三種不同的樣品制備方法相似。
圖4。使用OP9細胞裂解物檢測TaqMan miRNA的動態范圍。 每個RT體系中輸入細胞數范圍為3至2500個細胞。采用新桿狀線蟲elegans miRNA（MIR-2）作為陰性對照。
