哥大閔瑋組：新型顯微術突破傳統光學成像的顏色極限

　　生命科學研究水平的發展很大程度上要歸功于新型研究手段和生物技術的創新。其中，光學成像技術貫穿了生命科學研究的歷史與未來。上至17世紀列文虎克利用顯微鏡開創了微生物學，下到如今已經廣泛應用的熒光共聚焦顯微鏡，這個領域的每一次技術突破都極大地增強了人們認識微觀世界的能力。近年來，光學顯微鏡技術在不斷地突破自身的局限。例如2000年以來興起的超分辨熒光成像技術，已經突破了光學衍射極限。時至今日，人類進入大數據和系統生物學時代，另一個日益顯著的挑戰擺在眼前：在復雜的生物系統中，如何對多種組分進行無損，快速，高靈敏度的同時成像？傳統的熒光成像方法中，由于其探針發射光譜有較寬的寬度（～50nm），可見光波長區最多可以容納5種顏色。正因為此，最多5種生物組分能被同時成像。要想在復雜體系里根本性地突破這個“顏色極限”，需要尋求全新的光譜學手段以及發展相應的特異性探針系列。

　　美國哥倫比亞大學化學系閔瑋教授的團隊近日報道了一種全新的成像技術：電子預共振受激拉曼散射顯微鏡（Electronic Pre-Resonance Stimulated Raman Scattering Microscopy）。該技術結合了拉曼散射光譜窄（～1nm）以及熒光分析靈敏度高的優點。結合熒光成像技術，作者報導了24種顏色各異的探針，展示了多達16種顏色的活細胞成像和8種顏色的腦組織成像。這項工作近期發表于Nature上。

　　電子預共振受激拉曼散射是拉曼散射的一種特殊形式。拉曼散射信號通常很微弱，受激拉曼散射通過兩束滿足共振條件泵浦和斯托克斯激光與分子特定振動發生特異性耦合來增強信號。受激拉曼散射和生物成像的結合自2008年被哈佛大學謝曉亮教授在Science雜志報導以來（Science, 2008, 322, 1857-1861；閔瑋教授也是該技術的主要發明人），已經被廣泛應用在生命分析研究中。電子共振拉曼散射則是另一種增強拉曼信號的方法：當泵浦激光的頻率接近分子的電子能級躍遷頻率（即吸收波長）時，與電子能級躍遷耦合相關的分子振動光譜也被選擇性增強。因此，將電子共振拉曼散射和受激拉曼散射結合，可以極大地提升拉曼信號。然而當泵浦激光頻率嚴格等于分子的電子能級躍遷頻率時，分子不但會經歷電子共振受激拉曼散射，同時也有其他的泵浦-探測過程干擾檢測信號。作者發現，當泵浦激光頻率略低于分子的電子能級躍遷頻率（實驗發現與分子吸收峰相差2100波數左右）時，可以在實現最大的信號增強的同時，避免檢測背景的干擾。這項技術就是電子預共振受激拉曼散射，可以將以前普遍使用的無共振的受激拉曼散射信號提升1000倍左右，1毫秒內的對應檢出限在250nm，從而可以勝任大部分生物分子的成像分析。

　　接下來，閔教授團隊著力于尋找和開發合適的分子探針。由于選用的泵浦激光器波長在900nm左右，其對應的預共振拉曼探針吸收波長在650-750nm時，可以實現最佳的信號提升。這個波長段的商用分子探針，如Alexa647、Atto740等，都在C=C碳碳雙鍵區間顯示了特征的預共振拉曼譜。利用5種商用分子探針的預共振拉曼散射并結合3種熒光探針，作者實現了8種顏色的活細胞成像。為了進一步克服碳碳雙鍵區間波段非常擁擠的缺點，作者創新地發明和發展了一系列含有炔基（碳碳三鍵）和氰基（碳氮三鍵）的分子探針。由于炔基和氰基的拉曼振動在無干擾的2000-2300cm^-1區間有單一的特征頻率，且與生物體內常見基團有顯著區別，該區間的拉曼探針可以比在擁擠的“指紋區”實現更多的“顏色”。作者結合了同位素標記和結構修飾等策略，合成了28種吸收在650-750nm、三鍵振動頻率在2000-2300cm^-1的新型預共振拉曼探針。作者為他們取名為Manhattan Raman Scattering（MARS）調色板。

　　最后作者通過神經細胞和大腦切片的成像，展示了預共振受激拉曼散射顯微鏡及其相應探針技術在生命科學研究中的潛力。作者對小鼠海馬體神經細胞進行了體外培養，并用免疫標記的方法標記了5種不同的標志蛋白，用兩種正交的代謝標記對細胞內新合成的蛋白質進行脈沖-追蹤實驗，并用DNA染料確定細胞核的位置。通過對8種“顏色”的細胞圖像進行交叉對比分析，作者觀察到新生成的包涵體主要是由新合成的蛋白質構成。而星形膠質細胞中的內涵體遠多于神經元細胞。作者認為這個實驗支持了一個假說：星形膠質細胞可以將新合成的折疊錯誤的蛋白質隔離進入包涵體來減弱他們的毒性，然而神經元細胞沒有這種能力，因此對蛋白質調控的錯亂更加沒有耐受性。

　　在閔瑋課題組看來，預共振受激拉曼散射顯微鏡技術的發明，不但體現了課題組在振動光譜生物成像方向上十余年的積累，也彰顯了學科交叉的重要性。該項技術本身就可以看成是振動光譜與吸收光譜的協同，而發明過程也體現了新型顯微鏡技術與分子探針的完美結合。文章的第一作者魏璐（Lu Wei）博士是2017年美國化學會物理化學博士后獎得主，主導了預共振受激拉曼光譜學以及成像部分和神經生物學部分的工作，將于2018年在加州理工大學獨立領導實驗室。文章的第二作者陳知行（Zhixing Chen）博士和合作者共同完成了預共振受激拉曼探針的合成和表征。對于這項技術的未來應用，閔瑋課題組表示非常樂觀，相信預共振受激拉曼散射顯微鏡技術的發展可以使得科學工作者觀測和分析復雜生命體系變得更加容易，給神經生物學，腫瘤病理，微生物組學等方向的研究帶來助力。