8月19日，國際細胞自噬領域的核心期刊《自噬》在線發表了題為《Mir505-3p通過調控Atg12及自噬通路以影響神經元軸突發育》的研究論文。該研究由東華大學化工生物學院周宇荀團隊與中國科學院上海生命科學院神經科學研究所、腦科學與智能技術卓越創新中心仇子龍研究組合作完成。該研究利用CRISPR/Cas9系統構建了Mir505基因敲除小鼠，結合胚胎電轉技術和透射電鏡技術，報道了Mir505-3p基因通過靶向抑制自噬相關基因Atg12，負向調控自噬通路并促進神經元軸突發育的新功能。該研究提供了自噬對神經發育調控作用的新證據。
“自噬”即“自我吞噬”，是一種將體內衰老細胞器和包漿中內含物包裹、降解并得以循環利用的生理途徑。自噬最顯著的特點是需要合成名叫“自噬小體”的多層膜結構，在這種膜結構的包裹和呈遞下，內含物進入溶酶體系統并得以降解。盡管從上世紀七十年代起，神經元已是最早一批用來觀察和鑒定細胞自噬超微結構的細胞之一，但細胞自噬是如何廣泛地影響神經系統發育、神經退行性病變發生，以及如何調控軸突損傷后再生缺乏詳盡研究。近年來，關于神經系統中細胞自噬的基礎與臨床研究以及自噬通路關鍵基因動物模型的研究已成為目前醫學與神經系統疾病相關領域的重要課題。
周宇荀團隊在之前的研究中發現了一個與小鼠性發育相關的數量性狀座位（圖A），并且發現Mir505基因是潛在的調控者。另一項針對人X染色體連鎖的垂體發育不良癥的研究表明，Mir505同樣位于調控該疾病的數量性狀座位上（圖B）。由于哺乳動物性發育和垂體發育的本質都是神經系統的發育，因此，東華大學的科研人員試圖在神經系統中考察Mir505基因是否影響神經發育事件，并由此展開了與中科院神經科學研究所仇子龍研究組的課題合作。
科研人員首先利用體外培養的皮層神經元模型驗證Mir505基因是否參與調控神經元發育。研究發現，Mir505基因的一個成熟體Mir505-3p特異性促進神經元極性建立、軸突生長和軸突分支，但不影響樹突發育；而另一個Mir505基因的成熟體則不具備這一功能。科研人員利用胚胎電轉技術在小鼠體內皮層組織中觀察到了同樣表型。利用雙熒光素酶報告系統并結合生物信息學預測、神經元轉錄組測序數據，科研人員在神經元中篩選出Mir505-3p的靶基因為自噬相關基因Atg12。Atg12是細胞自噬通路上一個關鍵基因，其編碼的ATG12蛋白分子與ATG5蛋白和ATG16L1蛋白形成復合物，調控自噬小體早期形成和延伸。在本項研究之前，Atg12是否參與調控神經系統發育事件并不清楚。
為了研究Atg12對于神經元形態發育的功能，科研人員在體外培養的小鼠皮層神經元中分別運用脂質體轉染和電穿孔轉染兩種方式過表達Mir505-3p以及Atg12，發現Atg12顯著抑制神經元極性建立、軸突生長以及軸突分支，這些現象與Mir505-3p展現的功能相反。并且，共轉Mir505-3p可以恢復Atg12對于神經元軸突發育的抑制效果（圖C），這初步證實了Atg12抑制體外神經元軸突發育的現象。科研人員利用胚胎電轉技術觀察到，過表達Atg12可以恢復Mir505-3p對于體內同側皮層和對側皮層神經元軸突生長和分支的促進效果（圖D），進一步證實了Atg12抑制體內神經元軸突發育的現象。
為了進一步研究Mir505-3p對于小鼠神經元軸突發育是否必需，科研人員利用CRISPR/Cas9系統構建了Mir505基因特異性敲除的基因工程小鼠。通過HE染色、甲苯胺藍染色（圖E）以及免疫熒光染色（圖G），科研人員觀察到Mir505敲除小鼠在胼胝體、扣帶皮層和海馬傘等軸突富集區域信號減弱，但扣帶皮層處的成熟神經元數目沒有顯著變化（圖G）。這提示，Mir505基因敲除小鼠軸突信號減弱的原因并不是神經元前體細胞增殖受干擾，而是因為Mir505-3p對于小鼠軸突正常發育是必需的。利用這一小鼠模型，科研人員在透射電鏡下觀察到，在Mir505敲除小鼠體外培養的皮層神經元和小鼠皮層組織中（圖F）自噬小體發生顯著變化。基因敲除小鼠的自噬小體數目和面積顯著增加，而線粒體數目顯著減少。這表明，Mir505-3p對于維持神經系統正常自噬信號是必需的，敲除Mir505基因引起神經系統中自噬通路整體激活。研究表明，軸突發育過程涉及細胞微管系統骨架蛋白重排、膜蛋白以及眾多極性蛋白分子的合成與轉運，這些事件的發生均依賴于神經元充足的能量供給，因此，軸突局部的線粒體分布和線粒體移動性對于軸突生長和分支至關重要。Mir505基因敲除小鼠神經元胞體和軸突局部自噬小體增多并伴隨線粒體數目減少，進一步提示Mir505-3p最終通過自噬通路調控軸突局部線粒體分布以影響神經元軸突發育。科研人員在原代培養的MEF細胞中證實，Mir505-3p通過抑制Atg12廣泛影響著細胞自噬通路以及線粒體數目。
此工作利用神經元體外培養模型、體內胚胎電轉技術、電鏡技術和基因工程小鼠模型共同鑒定了Mir505-3p調控神經元軸突發育的表型，報道了Mir505-3p在神經系統中的靶基因是自噬相關基因Atg12，突出了microRNA和細胞自噬對于神經元軸突發育的關鍵作用，提出了Mir505-3p通過調控Atg12/自噬通路以影響軸突局部線粒體分布的全新信號通路及其分子機制（圖H），對深入理解自噬通路對神經系統發育的調控有重要意義。
該項工作由東華大學博士研究生、現中科院神經科學研究所博士后楊侃在周宇荀和仇子龍研究員的共同指導下完成，仇子龍課題組的其他成員俞彬、程誠、程田林、袁博積極參與，并得到了組內張月芳、單仕芳的技術支持，以及神經所共聚焦顯微鏡平臺胡謙、向丹、陳旭鑫，干細胞平臺張敏、錢嵩林、姜維芳，動物房平臺韓玲和電鏡成像平臺孔妤、潘立君、張賓、王旭的大力協助，是兩個課題組、眾多實驗平臺技術人員通力合作的研究成果。研究得到科技部973項目、基金委重大研究計劃培育項目、中科院戰略性先導科技專項、國家自然科學基金、上海市科委重點項目、東華研究生創新基金的共同資助。
圖注：（A）Mir505基因位于一個調控雌鼠性發育的數量性狀座位上。（B）Mir505基因位于一個影響人類X染色體連鎖的垂體發育不良癥的數量性狀座位上。（C）在體外培養的小鼠皮層神經元中，Mir505-3p通過抑制Atg12調控神經元極性建立、軸突生長和軸突分支。（D）體內胚胎電轉結果顯示，Mir505-3p通過抑制Atg12促進皮層神經元在對側腦室軸突生長和軸突分支。（E）甲苯胺藍染色指示Mir505敲除小鼠胼胝體處軸突發育異常。（F）透射電鏡結果顯示，Mir505敲除小鼠皮層腦組織中自噬小體數目和面積增加，線粒體數目減少。F圖中綠色偽彩指示自噬小體，藍色偽彩指示線粒體。（G）免疫熒光染色指示Mir505敲除小鼠的胼胝體、扣帶皮層和海馬傘處軸突發育異常，但扣帶皮層處成熟神經元數目正常。（H）Mir505-3p通過Atg12/自噬通路調控神經元軸突發育的機制圖。