基因療法進入臨床試驗，CRISPR基因編輯是在劫難逃嗎？

　　任何近期觀看過哥倫比亞廣播公司（CBS）網站上關于引發生物學醫學研究變革的CRISPR基因編輯工具的 60分鐘視頻片段[1]的人都會得出結論：這種基因編輯技術正處于開發出一連串治愈方法的邊緣。但是最近的一項研究[2]揭示出在部署這種著名的“分子剪刀”之后，一大堆染色體片段會發生缺失和重排。

　　CRISPR是2012年發現的，它出色地讓細菌抵抗病毒感染。這種“規律間隔性成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）”是簡單的DNA序列，在基因組中起著著陸帶的作用，在那里，經過改造的“向導RNA（gRNA）”將一種酶運送到所需的基因上，對這個基因進行修飾或移除。當這種酶沿著雙螺旋DNA進行切割時，天然的DNA修復隨后發生。Cas9是一種經常使用的DNA切割酶。

　　圖片來自Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4192。

　　與導入基因的常規基因療法不同的是，CRISPR會在精確的位置上交換或移除基因。不過，在去年12月，美國食品藥物管理局（FDA）花了27年的時間批準了首個基因療法Luxturna用于治療特定形式的遺傳性失明。因此， CRISPR藥物不會很快進入CVS（美國零售藥店巨頭）或沃爾格林（Walgreen, 美國醫藥零售巨頭）的貨架上。

　　在這項研究[2]中，來自英國威康基金會桑格研究所的研究人員并不是世界上首次報道CRISPR存在故障，而且肯定也不會是最后一次報道。

　　在對細胞開展的實驗中，Allan Bradley、Michael Kosicki和K?rt Tomberg研究了CRISPR的預期著陸位點之外的基因組區域，就像是在已知存在拼寫錯誤的書籍部分章節之外的其他章節中尋找錯誤。他們發現大量的DNA片段發生缺失、添加和翻轉，而且一些DNA片段甚至從原始的位置上經移除后被插入到其他的DNA位置上。盡管“脫靶”效應是廣為人所知的，而且關于CRISPR的小問題已被修復---更安全的酶、運送方法和檢測工具，但是早期的研究可能只見樹木不見森林。

　　這些研究人員沒有使用過去研究中使用的DNA修復和染色體發生變化的癌細胞，而是靶向來自小鼠的干細胞和經過“永生化的”人視網膜細胞中的一個得到很好研究的基因。這兩種細胞用于多種臨床基因編輯應用中。

　　就像飛機墜入玉米田一樣，CRISPR-Cas9在細胞內著陸，一次性吹走了數千個DNA堿基，最長的DNA片段有9500個堿基。這種損傷從靶位點上反射出來，引發染色體混亂，而單堿基突變（SNP）也出現，甚至出現在切割位點之外的區域上。通常，不止一件事情出了問題。這種損傷可能殺死細胞或者引發它發生癌變。

　　DNA片段缺失能夠暴露隱性的基因變異；無論發生在什么地方，DNA片段插入和易位改變了基因控制。將一個基因移動到一個致癌基因附近的位點可能會產生第一次突變“命中”，當第二次突變發生時，這次突變命中會在生命后期引發癌癥產生。這些研究人員猜測“在對數十億個細胞進行編輯的臨床環境下，產生的大量不同突變使得每個實驗方案中的一個或多個經過編輯的細胞可能發生重大的致病性病變。”

　　這些實驗存在著多種對照和復核：不同的遞送方法（電穿孔而不是病毒載體）；不同的靶基因；具有易于區分的染色體組的小鼠雜交品系，就像是將白色和黑色襪子放入干衣機中隨后產生拼湊物；重復干預四次。這些研究人員總結道，“潛在的缺失結果的多樣性是巨大的。”

　　事后影響？

　　經過編輯的基因組的這種不可預測的結果是否會減慢進入臨床試驗的軌跡，或者至少能夠緩解炒作？人們對此存在著不同的觀點。

　　作為美國北卡羅來納大學和德克薩斯大學西南醫學中心的一名基因治療先驅，Steve Gray將CRISPR沖刺與基因療法的馬拉松比賽進行了對比。“據我所知，CRISPR涉及的明顯且重要的安全問題尚未得到解決。這種技術是非常令人興奮的，但是CRISPR可以從基因療法的歷史中了解到走得太快的后果，畢竟很多基礎生物學特性和風險尚不完全清楚。”

　　Steve Gray將病毒載體比作為運送包裹的FedEx卡車。如果說傳統的基因療法運送包裹到建筑物中，那么基因編輯則將它傳遞到特定書桌中的特定抽屜里。

　　Gray開創性地開發出針對貝敦氏癥（Batten disease）、雷特綜合征（Rett syndrome）、戴薩克斯癥（Tay-Sachs disease）、克拉伯氏病（Krabbe syndrome）和巨軸索神經病（giant axonal neuropathy）的基因療法[3]。在1999年的一項臨床試驗中一個年齡18歲的人死亡和兩年后的另一項試驗中出現患上白血病的副作用后，基因療法臨床試驗就停止了。

　　開發CRISPR的公司淡化這種技術的危險，指出斷裂的染色體是DNA自然修復的一部分。Intellia治療公司（Intellia Therapeutics）的 Jennifer Smoter解釋道，“Intellia治療公司不認為這些發現會顯著影響基于CRISPR的療法的前進之路。正常細胞中的DNA在沒有其他的干預的情形下會持續地經歷斷裂、修復和其他的重排。在DNA斷裂后發生大片段缺失在本領域中是已知的。分裂細胞（dividing cell）使用高保真修復：切除位于雙鏈DNA斷裂兩側的較長DNA片段，并且這些觀察到的缺失可能來自于這個過程。”“采用任何基因組編輯技術或自然發生的斷裂都會觀察到這種”影響。也就是說，這個問題在于自然的DNA損傷/修復反應，而不是基因編輯工具。

　　Intellia治療公司使用脂質納米顆粒運送系統對一些單基因疾病和癌癥進行了臨床前研究。到目前為止，針對小鼠和猴子的實驗沒有顯示出癌癥的跡象，不過這家公司正在靶向肝細胞，而不是這些來自威康基金會桑格研究所的研究人員使用的快速發生分裂的細胞。Smoter補充道，細胞選擇可能解釋了較大的DNA片段缺失。

　　Editas醫學公司（Editas Medicine）發言人Cristi Barnett回應道，“非預期的基因組變化（包括這些研究人員描述的那些變化）的產生適用于所有基因組醫學方法，從基于慢病毒隨機插入的方法，如用于CAR-T細胞療法中使用的那些方法，到基因組切割方法，如鋅指核酸酶（ZFN）、megaTAL核酸酶和CRISPR。”

　　Barnett補充道，該公司的臨床前實驗正在淘汰對細胞的治療相關性產生不利影響的干預措施。“關于CRISPR的一個好處就是對它有如此多的興趣，并且有很多人在研究它。但是，再一次地，在我們努力開發基于CRISPR的療法的過程中，我們注意到但并沒有特別關注這一最新的研究成果。”

　　對于非分裂細胞，CRISPR可能會更安全嗎？

　　德克薩斯大學西南醫學中心分子生物學教授Eric Olson認為如此。他的團隊利用CRISPR和一種不同的輔助分子（即Cpf1）在小鼠體內和不能分裂的人心肌細胞中校正導致杜氏肌肉營養不良癥的基因突變。“這項研究的結果不應該被過度解讀。對破壞性的肌肉疾病而言，它是一種警示說明，但不是阻礙進展的障礙。”由于肌肉細胞不會分裂，它們不會變成癌細胞或傳遞受損的基因。

　　展望未來

　　如果有任何方法讓CRISPR基因編輯進入臨床的話，那么它有很多需要加以優化的變量。采取的策略就是使用不同的修復機制；運送途徑；細胞類型；靶基因；分子剪刀和gRNA。

　　與哥倫比亞廣播公司網站上的關于CRISPR的60分鐘視頻片段中的激情澎湃的非常炫麗的聲明不同的是，ClinicalTrials.gov網站上關于利用CRISPR的療法的名單僅有17個條，這是有些奇怪的。這個名單包括一個在無實體的內臟中開展的實驗；研究鐮狀細胞病患兒的父母的“知識、態度和信仰”；遺傳性麻醉不耐受的自然史研究，這都與基因編輯無關。大多數利用CRISPR的療法來自中國。很明顯，炒作遠遠超過現實。

　　關于CRISPR基因編輯未來的最后一句話來自1990年的French Anderson，他領導了第一個用于治療遺傳性免疫缺陷的基因治療臨床試驗。

　　“CRISPR-Cas9的情況類似于許多新的顛覆性技術。最初由于新的可能性而引起人們巨大的興奮。隨后發現了有害的副作用，這種興奮之情大幅下降。經過長時間的努力，這種技術的全部價值得到實現。這正是基因治療經歷的事情。CRISPR-Cas9是一種非常強大的技術，將在未來得到廣泛使用。這種意想不到的基因組損傷只是一個亟待解決的問題。”

　　隨著時間的推移和合適的分子工具出現，就像基因療法一樣，CRISPR將找到自己的方式進入臨床治療。