質譜沙龍第三十六期活動報道

　　2012年7月21日下午，第三十六期質譜沙龍活動在北京市朝陽醫院職業病與中毒醫學中心如期舉行。來自北京朝陽醫院、北京大學人民醫院、AB SCIEX公司、中國科學研究院、北京安定醫院等二十余名專家、學者、技術工程師參加了本次沙龍活動。本次沙龍涉及生物分析、代謝組學、小分子定性、小分子定量、大分子的應用等方面的內容。

第三十六期沙龍活動現場 分享與傾聽

首都醫科大學附屬北京朝陽醫院職業病與中毒醫學中心 李惠玲

　　李老師首先對北京朝陽醫院毒物化學分析實驗室做了簡單的介紹，其次介紹了ICP-MS同時測定全血中多種元素的方法。

北京朝陽醫院毒物化學分析實驗室介紹

　　北京朝陽醫院毒物化學分析實驗室從2005年開始建立并運行。希望通過沙龍擴展在毒物化學與分析方面質譜應用的新的思路。

　　目前毒物化學分析實驗室配備的儀器有GC-MS、ICP-MS、原子吸收分光光度計、原子熒光光度計、紫外-可見分光光度計、微波消解儀等先進的儀器、擁有比較完善的專業隊伍。在國內的綜合性醫院中，朝陽醫院的硬件和檢測水平位居前列。朝陽醫院毒物化學分析實驗室可以滿足北京地區各級醫療機構和患者毒物檢測的需求，并同時承擔國家和北京市突發化學品中毒臨床救治任務。實驗室日常的毒化檢測項目包括六個方面：生活中毒、職業接觸、意外接觸、治療用劑、代謝疾病的檢測、微量元素的檢測。檢測的化合物包括33種農藥類和4種鼠藥類物質。

ICP-MS同時測定全血中多種元素

　　李惠玲老師作了題為“血清中21種元素的直接進樣動態反應池ICP-MS測定”的報告，主要從樣品前處理方法、進樣方式、內標物、基質、DRC條件的選擇的幾個方面介紹了ICP-MS同時測定全血中多種元素的具體方法。

　　在現代醫療臨床及研究中，人體中的微量元素越來越成為人們關心的焦點了，通過血液中元素的檢測可以為相應疾病的診斷治療提供依據。目前廣泛用于人體血液中元素檢測的儀器主要有原子吸收光譜、ICP-OES，前者由于有相關的行業標準，檢測的應用比較多，但檢測速度慢，并不適合做多元素同時檢測。后者對于有些元素的檢測靈敏度比較低，不適合做痕量元素的檢測。

　　樣品前處理方法的選擇

　　采用簡單的硝酸溶液稀釋法，將樣品稀釋后進樣檢測。實驗發現當硝酸濃度大于1%，會造成全血樣品中蛋白質破壞產生沉淀，因此采用1%硝酸溶液作為稀釋劑。

　　進樣方式的選擇

　　為了操作方便并考慮到在線內標加入具有一定的稀釋比例(樣品進樣采用內徑為0.38mm的泵管，內標采用內徑為0.76mm的泵管，相當于3倍稀釋)，采用1.5mL的離心管作為容器，分別用微量移液器移取0.5mL待測血清和1.0mL1%硝酸溶液搖勻測定。

　　內標物的選擇

　　對于質量數小于80的元素，李老師在初期設計了采用Sc的內標物，但在實際工作中發現即使是在純水溶液中，⁴⁵Sc的離子計數也達到了8000-10000cps，同時在實際血清樣品的檢測中，離子強度變化較大，樣品中Ca、Si等元素含量的不同將導致內標強度的穩定性變差，最后確定了使用Rh作為內標元素，并根據強度的大小將濃度定為2ug/L。對于質量數大于100的元素，考慮的不僅需要內標元素，最好還能消除Hg的記憶效應，因此最后采用Au作為內標元素，濃度為2ug/L。

　　基質的選擇

　　適當濃度的有機溶液對離子的檢測具有增敏作用，從實際操作簡便性及使用成本考慮，采用無水乙醇作為有機溶劑。樣品中也含有大量的有機物，因此通過高濃度的有機溶劑加入可以將標準溶液和樣品大致做一個基體匹配，通過實驗最后確定乙醇的濃度為2%。

　　干擾的消除及動態反應池(DRC)條件的選擇

　　對于一些元素或離子的檢測存在大量的干擾，在實驗過程中采用DRC技術消除干擾離子。在DRC中，通入選定的反應氣體，氣體與干擾離子進行化學反應滯后其質荷比將會發生改變，由此通過四級桿的質量過濾功能將其消除。

北京大學人民醫院 趙立波

　　北京大學人民醫院藥劑科的趙立波老師的報告的題目為“代謝組學研究簡介及Qtrap用于代謝組學的初步探索”，主要介紹了代謝組學研究的簡要情況和Qtrap用于糖尿病代謝組學研究的初探。

　　代謝組學的基本概念

　　代謝組學研究的對象是一些代謝產物，這些代謝產物以元素組成、院子排列、立體結構和分子結構來區分，檢測代謝產物的方法就各不相同。代謝組學是“組學”研究的最終方向，對生物體的代謝情況提供一種由全局向細節的研究思路，是基因組學和蛋白組學的延伸乃至它們在代謝層面上的集合。

　　代謝組學各分析流程技術包括樣品的提取、樣品預處理、化合物的分離、檢測及鑒定、數據分析與可視化、建模與仿真。

　　代謝組學的研究方法中對于單個細胞或細胞類型的小分子成分采用GC、LC、CE-MS的方法進行分離、檢測與鑒定，而對于生物體液和組織進行系統測量和分析時需要采用NMR的方法。這兩種分析技術各有優勢，前者有較高的靈敏度和繳款的動態范圍，但是檢測較費時且樣品前處理的過程較復雜。后者具有無損傷性、無偏向性的、良好的客觀性和重現性、能夠高通量檢測的優點，但是靈敏度較低，動態范圍有限。

　　Qtrap用于糖尿病代謝組學研究的初探

　　2型糖尿病(DM)是人類最主要的致殘和致死因素之一，病因呈高度異質性，受遺傳、環境、行為等因素的綜合影響。作為一種代謝綜合征，糖尿病很難用單一的評價指標和發病機制來反映其發生及變化，同時檢測多成分的代謝組學，可以作為研究的手段之一。國外研究發現脂肪酸、色氨酸、尿酸、膽汁酸、溶血磷脂膽堿含量變化有著顯著性變化，被認為是2型糖尿病的特征性變化，為如何鑒定漫長且無癥狀表現的2型糖尿病前期提供了一種有效的方法，對該病早起的診斷和預防有著重大的意義。國內也有大量研究表明甘油三酸酯、脂肪酸和乙酰乙酸這三種小分子代謝物的含量變化具有顯著性差異，可能成為糖尿病診斷的潛在生物標記物。

　　目前已有的糖尿病代謝組學質譜分析方法具有一定的局限性，研究對象只能是n<50的臨床小樣本，研究方法缺乏充分證據。

　　趙老師講到，人類已知的小分子代謝物大約有2500種，能被常規儀器檢測的大約有1200種，但無法確定其所有的結構;目前國際一流的代謝組學實驗室通常能一次性在一個生物樣本中同時鑒別出400-600個內源性代謝物。

　　儀器日內與日間精密度的考察

　　趙老師選擇可檢出的15種標準物質與2種內標進行精密度的考察，配置混合溶液1/3MIX、1MIX、3MIX，40℃氮氣流吹干，用健康人尿液復溶，漩渦振蕩10min，轉移至EP管13400rpm離心10min，取上清過0.22um水系濾膜，進行質譜分析。分別采用+EMS、-EMS方法檢測。結果用MarkerView進行提取，采取外標法與內標法分別進行計算，得到的數據進行日內與日間精密度的計算。

　　討論

　　代謝組學研究的對象是相對分子質量1000以下的內源性小分子化合物。人體中各類內源性小分子代謝物有上萬種，各種代謝物的濃度范圍和物理化學性質差異很大。目前沒有一種分析技術對機體中所有的代謝物進行分析。

　　人類已知的小分子代謝物約有2500種，能被常規分析儀器檢測到的大致有一般，但尚無法確定其所有的結構。

　　近年來NMR、MS與多種分離手段聯用成為代謝組學中的重要分析工具，目前世界上較好的代謝組學實驗室通常能一次性在一個生物樣本中同時鑒別出400-600個內源性代謝物，可見代謝組學分析測定方法學還有很大的上升空間。

　　關于Qtrap應用于代謝組學的方法學研究，近年來有少量報道。已有的研究均沒有體積LS-MS方法的日間變異，也沒有選用合適的內標對變異的進行校正，僅僅用于小數量生物標本的測定，難以滿足大樣本研究的需要。

　　趙老師的研究建立了一種基于三重四極桿-線性離子阱雜交質譜技術的代謝組學分析方法，著重對該方法的變異性進行了論證。在選定的色譜質譜條件下，15種內源性代謝物的日內變異小于20%，而日間變異較大，內標的運用對變異的控制無明顯改善。LC-QTRAP應用于代謝組學生物標志物的篩選還有很大的改進空間。

　　代謝組學是一種半定量的研究方法，注重的是對所有代謝物的檢測及其峰強度的比較。趙老師的研究是將低、中、高三種濃度的標準品與健康人尿樣混合作為模擬生物樣品，檢測結果可為代謝組學生物樣品的檢測提供合理的評價。由于日間變異較大，進行代謝組大樣本檢測時，分析得到的生物標志物必須通過其他方式進行驗證。

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首都醫科大學附屬北京朝陽醫院藥事部 李鵬飛

　　北京朝陽醫院藥事部李鵬飛老師分享了WHO生物分析方法學的相關內容。李鵬飛老師去年和今年參加了WHO有關生物分析的兩次培訓會。李老師將兩次培訓的內容總結與大家分享。

　　分析方法學的全面確認

　　包括五個方面的內容：選擇性、殘留效應、定量下限、標準曲線、準確性。

　　選擇性

　　要求有六個來源的空白基質，并且空白基質中的響應小于定量下限(LLOQ)的20%，才能認為空白里是沒有基質干擾的，否則空白是不合格的。比如做方法學驗證時，三條曲線三個空白，可能第二個空白會有小峰，WHO的規定是小峰的面積不能超過定量下限峰面積的五分之一。還提到了代謝物、降解產物和聯合給藥可能產生的干擾。

　　殘留效應

　　對于殘留效應，國內做的比較少，首先保證它不會影響準確性和精密度，先注射高濃度的樣本，再注射空白溶液，空白樣本出峰要求<20% LLOQ、<5% IS。

　　如果無法避免，則應采取具體的應對措施。樣本分析中還要避免隨機化。

　　定量下限

　　檢測方法能夠定量的最小藥物濃度必須小于給藥后達到的最大濃度的10%，即定量下限(LOQ)小于1/10Cmax。WHO對生物等效性要求較松。

　　校準曲線

　　與實際樣本相同的基質，每個分析批一條標準曲線，確認三條標準曲線。在研究階段，應在預期濃度范圍內進行，建議至少應在濃度范圍內選擇五個(EMA的規定為六個)濃度進行試驗(不包括空白和零點)，大于75%的曲線上點合格。必須提交相關系數，回歸y截距和斜率。對于校準品相對回歸曲線的偏差，應進行分析，以便評估其線性。反向計算濃度的準確度小于15%(LLOQ除外：<20%)。建議在確認過程中使用最新的校準曲線。

　　準確性

　　應在摻加已知量分析物的樣本中來評估準確性/精密度，使用至少3個濃度水平(低、中、高)的結果來評估準確性/精密度。準確性應報告為加樣回收率。精密度為變異系數(標準差/平均值)。

　　BE研究生物分析分析方法的驗證

　　局部驗證

　　如果已驗過的分析方法有了輕微的變化，包括生物分析方法轉移到另一個實驗室，設備、校準濃度范圍、儲存條件等的變化。重新驗證或部分驗證的范圍應該是合理的，在大多數情況下，就修改問題而言，應提供足夠的附加精確度和精密度數據和相關穩定性的數據。

　　交叉驗證

　　如果數據是從不同的研究基地取得的，則應當對所采用的分析方法進行檢查驗證。例如，樣品制備的差異，或使用另一種分析方法。應該在分析研究樣品前進行，同組QC樣品應以兩種分析方法進行分析，兩次測量之間的差異不應超過15%。

　　臨床樣本分析的要求

　　臨床樣本分析應在開始采集臨床樣本之前，對分析方法進行確認。每個分析運行應包含充足的QC樣本，此類樣本應處于開始、中間和結果等至少3個水平(LQC、MQC和HQC)。在實際開始對臨床樣本進行分析之前，應預先確定批次的接受和拒絕標準。

AB Sciex公司 李春波

　　最后來自AB SCIEX公司的李春波博士為大家帶來了題為“SWATH技術與TripleTOF平臺”的精彩報告。

       SWATH技術

　　SWATH技術是AB SCIEX與Prof.Ruide Aebersold及其團隊共同開發的，該技術為蛋白質組學研究帶來了一種全新的工作流程。SWATH技術將掃描范圍劃分為25Dalton為間隔的一系列區間，通過超高速掃描來獲得掃描范圍內全部離子的所有碎片信息，是MS/MS^ALL技術的擴展。SWATH技術通過TripleTOF 5600平臺實現，可同時提供完整的定量與定性結果，不需要進行方法優化，獲得所有化合物的信息，可以對所有化合物進行查詢，高分辨率的定量結果減少了潛在的干擾物，定量能力達到三重四極桿質譜的水平。

　　李春波博士以地圖全貌的方式，來形象地比較SWATH與MRM^HR采集模式的不同。MRM^HR采集雖然很精細，但卻無法讓我們看到整個全部的圖；而用SWATH采集，首先可以看到全貌圖，然后可以找出和MRM^HR采集同樣的詳細圖譜。SWATH的采集方法得益于AB SCIEX TripleTOF^TM技術的超高采集速率和高分辨、高質量準確度；在一次分析中，可鑒定和定量樣品中的幾乎所有肽段和蛋白質。

MRM、MRM^HR以及SWATH間對比圖

       TripleTOF^TM 5600/+系統應用于蛋白質組學

　　(1)具有高靈敏度的特點，更多低豐度的蛋白質能被檢測和鑒定出來；

　　(2)SmartSpeed^TM 100Hz譜圖采集頻率。定性時，單位時間內，相比任何質譜，IDA更多時間用在MS/MS上，保證質譜對復雜樣品的挖掘深度，提高對復雜樣品檢測的實際靈敏度，從而鑒定到更多的蛋白質。定量時，不論MS或者MS/MS，都能獲得更多的數據點，使得定量數據更可靠；

　　(3)高分辨率(>40,000)，無論是低分子量區和高分子量區，還是低掃描速度和高掃描速度下，都能達到高分辨率，滿足蛋白質組學中對分辯率的絕大多數要求，對從頭測序、iTRAQ提供最好的支持；

　　(4)EasyMass^TM質量準確度(<1ppm)，MS和MS/MS都能達到，提供更可信的蛋白質鑒定系統；

　　(5)定量線性動態范圍>4個數量級，是所有高分辨率質譜中定量能力最強的。

       TripleTOF^TM 4600

　　TripleTOF^TM 4600 在2012年全球首發于北京，是高性價比質譜平臺，用于常規性/定量分析，以無與倫比的高采集速度，獲得高靈敏度、高分辨率、高準確度的一級和二級質譜數據。

　　(1)具有AB SCIEX公司優勢的離子源和通路設計，其一級MS和二級MS/MS均具有超高靈敏度；

　　(2)具有高分辨率：在TOF MS和MS/MS掃描模式下>25,000；

　　(3)快速數據采集：高達100 Hz的采集速度，或在IDA(智能實時數據過濾)模式下每秒采集多達50張二級MS/MS 譜圖；

　　(4)具備高質量準確度，和簡潔質量校正能力，在分析檢測復雜蛋白質組時<1ppm RMS；

　　(5)寬動態范圍確保出色的定量性能，線性動態范圍高達4個數量級。

　　(6)TripleTOF^TM 4600系統也具有三種工作模式，分別為定量分析模式、定性分析模式、全景分析模式，具備同時定性和定量的完美性能。該系統最大的亮點是它可以在一次運行中鑒定更多的蛋白，并將這些信息轉化為靶蛋白質組學分析，重新分析樣品而無需切換平臺。使用4600系統，研究人員將大大簡化他們的工作流程，因為對大量生物樣本的定性和定量分析實驗可以再同一系統上完成。

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