分級定量PCR檢測血清HBVDNA

引言
　PCR技術對基因從定性到定量的測定是分子生物學方法研究一大飛躍，定量PCR已成為目前分子生物學技術研究的熱點之一. 迄今研究和應用的定量PCR方法有4種，即PCR產物的直接定量；極限稀釋法；靶基因與參照基因的同步擴增；競爭性PCR法. 以上方法各有利弊，選擇某一方法取決于靶基因的特性，對準確度的要求，需要相對還是絕對的定量. 其中競爭性PCR方法的定量比較準確，被較多地采用［1］. 但該方法在實際應用時，需將恒量的樣品DNA與一系列稀釋的各種濃度的競爭性模板混合后進行PCR擴增，zui后進行電泳，找出待測模板與競爭性模板終產物有相等摩爾數的一個反應，從而確定待測模板的初始量. 因此，對一個樣品定量時需要進行多個反應，不適應多樣品的同時定量測定. 我們建立了分級定量方法，只用3種濃度的競爭模板與恒定量樣品DNA進行3個PCR反應，通過測定待測模板與競爭模板的終產物熒光強度比值，來確定待測樣品DNA的初始模板量. 該方法適合多樣品同時測定.

目的　利用競爭PCR法建立分級測定HBV DNA含量的定量方法.
方法　設立3個標準競爭模板（102cop, 104 cop, 106cop），分別和恒量的待測模板混合，分別進行40，30，20次循環的PCR擴增，zui后凝膠電泳分離待測模板和競爭模板的PCR產物，測定兩者的熒光強度的比值，計算待測模板的初始量.
結果　對乙型肝炎血清HBV DNA定量表明，12份HBeAg陽性血清，HBV DNA的血清濃度在6×107～1×1011cop/L，而12份HBeAb陽性血清只有7份可檢出HBV DNA，它們的血清濃度均在3×108cop/L以下，其余5份用該PCR方法，檢測不到.
結論　該方法可用于HBV DNA以及其他病原體DNA的定量.

1　材料和方法

1.1　材料　GQS-960凝膠成像分析系統（第四軍醫大學基因診斷技術應用研究所），Thermolyne PCR擴增儀（美國）,Taq DNA聚合酶，dNTP （Promega公司）. 引物出自HBV DNA的X區，經oligo軟件設計. 引物位置和序列為：B1（1402-1421），5,-ATC CTGCGCGGGACGTCCTT3；B2（1626-1607）5,-CGTTCACGGTGGTCTCCATG3擴增比較為225bp，由上海深工生物工程公司合成.
1.2　方法　含靶序列的PUC 19質粒和競爭序列的PUC19質粒，將B1，B2引物擴增HBV DNA的產物克隆入PUC19，該質粒作模擬靶序列用；競爭模板是在正常的B1，B2引物擴增產物中央部插入一段人工合成的40bp的DNA片段，并克隆于PUC19，該質粒作定量實驗的競爭模板. 血清處理，主要按酚/氯仿抽提，乙醇沉淀的方法［2］提取血清中HBV DNA，血清用量為300μL，zui后所得HBV DNA等分3份作定量PCR擴增. PCR擴增取上述純化的HBV DNA（各5μL）分別加入三個定量反應管中，其中的競爭模板量分別為102cop,104cop,106cop. PCR反應成分為50mmol/L KCl，100mmol/LTris-HCl pH 8.3，1.5mmol/L MgCl2， 200μmol/L dNTP，B1，B2引物各30pmol. Taq DNA聚合酶1U，反應總體積30μL. 反應程序為：94℃預變性2min，然后94℃ 30s，55℃ 40s, 72℃ 50s分別循環40次，30次，20次后，72℃延伸5min，zui后各準確取10μL PCR反應產物，進行40g/L瓊脂糖凝膠電泳［3］. 熒光強度測定：將用溴化乙錠染色的凝膠板置于GQS-960型凝膠呈像分析系統上進行掃描，測定熒光強度比值［4，5］，并用微機計算結果.

2　結果

2.1　競爭模板與待測模板擴增效率比較　對3個待測模板與競爭模板的PCR產物熒光強度比分別為10∶1；1∶1；1∶10的反應液進行106倍稀釋，再各取3μL稀釋后溶液進行PCR擴增，循環30次，結果兩者熒光強度之比仍為10∶1；1∶1；1∶10. 說明所用引物對待測模板與競爭模板的擴增效率相等.
2.2　引物對兩種模板的檢測靈敏度　將提取并純化的含有兩種模板的兩種質粒定量后，按2×105，2×104，2×103，2×102，20 cop分別進行PCR擴增反應，擴增40次循環，結果兩種模板都被檢測到20 cop的模板量.
2.3　標準曲線
2.3.1　標準曲線1　將102 cop的競爭模板分別與20，40，60，80，100，200，400，600，800，1000，2000，4000 cop的待測模板（含靶序列的PUC19質粒）混合后進行40次PCR擴增. 測定待測模板與競爭模板的PCR產物熒光強度之比（Ax/Ao），并以1g（Ax/Ao）作縱坐標，以待測模板初始量的對數lgX為橫坐標作標準曲線1（以下作法相同）.
2.3.2　標準曲線2　將104 cop的競爭模板分別1×103，2×103，4×103，6×103，8×103，1×104，2×104，4×104，6×104，8×104，1×105，2×105，4×105 cop待測模板混合后，分別進行30次PCR擴增，作標準曲線2.
2.3.3　標準曲線3　將106 cop的競爭模板分別1×105，2×105，4×105，6×105，8×105，1×106，2×106，4×106，6×106，8×106，1×107，2×107，4×107 cop的待測模板混合后，分別進行20次PCR擴增，作標準曲線3.
2.4　臨床樣品的檢測結果　用該定量法對24份HBV感染者的血清進行定量測定，其中12份HBeAg 陽性的血清PCR檢測HBV DNA為陽性，HBV DNA在血清中的含量6×107～1×1011/L之間（8×109，6×107，5×1010，4×108，10×1010，5×108，1×1011，7×108，9×108，7×1010,4×109,5×109 cop/L），平均在2.1×1010/L. 而12份HBeAb陽性血清進行測定時，其中7例血清PCR可檢出HBV DNA陽性，HBV DNA在血清中的濃度在2×105～3×108 cop/L（6×106，4×106，2×105，5×105，3×108，7×105，1×106 cop/L）. 而其余7份血清PCR檢測HBV DNA為陰性.

3　討論

　用競爭性PCR定量的基本條件是靶序列和競爭性序列用相同的引物，并以相同的效率擴增［1］. 在本實驗中，我們采用一對引物對待測靶序列和競爭序列同時擴增，競爭序列是在靶序列中央插入40bp人工合成的DNA片段而來的，這樣就保證了靶序列與競爭序列有相似性，使擴增效率相接近. 實驗證明，我們設計的競爭模板與待測靶序列有相同的擴增效率，即兩者開始的比值經擴增后沒有改變，這就保證了本定量實驗的可行性. 插入40bp序列也足以使擴增后的兩種產物能在瓊脂糖凝膠上被分離開. 但這段序列又不能太長，以免擴增效率和待測模板不一致. 在實驗中為了使兩條擴增帶不相干擾，PCR擴增一定要保證特異性擴增. 為此該定量方法要求按嚴格的標本處理方法提模板DNA，同時對不同濃度范圍內的模板按不同的循環次數擴增，即20～103 cop/每管的PCR用40次循環擴增；103～105cop/每管的PCR用30次循環擴增，105～107cop/每管的PCR用20次循環，這樣不僅可以保證低濃度模板能被擴增出來，同時高濃度模板經擴增不易出現非特異擴增帶，這樣就有了定量的前提條件.
　　該方法的理論基礎為Ax/Ao=（225Yx）/（265Y0）=［225X（1+e）N］/［265M0（1+e）N］. Ax/Ao為待測模板與競爭模板的擴增產物帶熒光強度比；Yx/Yo為待測與競爭模板擴增產物拷貝數之比；225bp為待測模板的長度；265bp為競爭模板的長度；X為待測模板的初始量；Mo為競爭模板初始量；e為擴增效率；n為循環次數. 由于本實驗中兩種模板擴增效率相同，循環次數相同，上式就變為Ax/Ao=225X/265Mo，取對數后為1g（Ax/Ao）=lgX+1g（225/265Mo）. 因此，1gX與1g（Ax/Ao）成線性關系［6］. 但在作分級定量的3個標準曲線時，當靶序列比競爭序列的拷貝數大于10倍以后，標準曲線就漸漸偏離理論值，斜率逐漸增大. 這是由于當待測序列的初始模板量大于競爭序列10倍以上時，經過一定的擴增循環后，待測序列的擴增產物量急劇增大，這些產物所產生的熒光強度已接近或超過了檢測系統的飽和限. 因此Ax值增加幅度很微小，直至飽和，此后Ax的測量值不再變化［7］. 而另一方面由于PCR反應體系中各種成分迅速被大量的待測序列及其產物占有，競爭序列的擴增就受到強烈地限制，zui終擴增產物下降到A0值接近0. 因此我們看到隨著待測序列分子數量增加，標準曲線將迅速上升. 為此我們每一級的定量范圍在標準競爭模板量的10±1之間.
　　在定量測定時，我們采用GQS-960凝膠成像及分析系統，對待測及競爭模板的擴增帶進行熒光強度比較，經微機計算出相應的待測模板拷貝數. 該方法仍采用溴化乙錠染色，紫外燈下測定熒光. 因此過去有定性PCR設備的實驗室，只需購買一套凝膠熒光強度檢測儀就可以開展工作. 該定量法不需象以往競爭PCR定量方法那樣，測定一個樣品DNA要有一系列稀釋的競爭模板來標定，而是只要作3個定量（與102，104，106cop競爭模板混合）反應就可zui終定出待測DNA模板的拷貝數. 用該方法分別對12份HBeAg陽性和12份HBeAb陽性血清進行定量分析，結果前12份血清均可檢測到HBV DNA，并且血清濃度為6×107～1×1011cop/L. 而后12份只檢出7份HBV DNA陽性，其在血清中的含量在2×105～3×108 cop/L之間，還有5份血清用該PCR方法未檢出HBV DNA. 以上定量結果與文獻報道的相近［3］. 上述結果也說明了為什么用簡便的處理血清方法進行PCR擴增時，HBeAb陽性血清大部分往往檢測不到HBV DNA的原因. 因為一般抗HBeAb陽性血清中HBV DNA含量較低（在3×108 cop/L以下），而簡便血清處理方法zui多只取相當于2μL血清中的HBV DNA作PCR擴增，按上面結果計算只含有0.4～6×102 cop. 因此就有一大部分不能被檢測出來.
　　總之，該方法操作簡便，結果準確，可用于臨床定量檢測各種病原體的DNA.