PCRArray簡單實用的檢測基因表達的高通量方法

簡介：什么是PCR芯片？

實時定量PCR是檢測基因表達zui靈敏，zui可靠的方法。通過在試驗過程中，實時監測熒光染料的信號變化，反映樣品中的基因拷貝數。實時定量PCR線性范圍廣（能達到5個數量級），因此可以檢測同一樣品中表達量極低的基因和表達量很高的基因。但是，由于實時定量PCR需要制備標準曲線和同時分析內參基因，因此，每次實驗只能檢測少數幾個基因的表達水平，若要檢測大量基因，則工作量巨大，耗時長久。

通過簡單的，經過優化的實時定量PCR體系，如SuperArray的RT²Profiler^TM PCR芯片，研究者可以同時研究大量基因，既可以進行某些特別感興趣的信號通路的研究，也可以作為驗證芯片結果的方法。

為了獲得理想的實驗結果，PCR芯片面臨以下挑戰：高特異性，高靈敏度和可重復性。高靈敏度或低檢出限，在樣品的總RNA量少，基因表達量低的情況下，也能檢測出目的基因。高特異性，擴增產物嚴格保證基因特異性，避免非特異性產物，如引物二聚體的產生。可重復性，通過標準化的反應體系和實驗方法，使得多人多次重復實驗均能獲得可靠的基因定量結果。

PCR芯片實驗操作步驟

采用PCR芯片進行實驗只需2小時。PCR芯片實驗過程如圖1所示：首先將RNA樣品反轉錄為cDNA*鏈，作為PCR模板；接著，將模板加入到反應體系（RT² Real-Time^TM SYBR Green PCR Master Mix）中。在已經固定好基因特異性引物的96孔板各孔中，加入等量的PCR反應體系，進行PCR反應。采用儀器配套的軟件計算PCR芯片中的每個基因的循環閾值（Ct）。zui后，采用△△Ct方法比較對應的兩個樣本中同一基因的表達量變化。通過分析看家基因Ct值的一致性，可確定合適的標準化方法。芯片所設置的對照，可以檢測PCR體系中是否存在DNA污染，或者是否有影響反轉錄或PCR實驗步驟的因素存在。

  圖一 PCR芯片實驗流程

PCR芯片的設計和所包含的基因

96孔模式的每種RT²ProfilerPCR芯片，含有基因特異性引物，可用于研究84個與某種信號通路或者疾病相關的基因。此外，芯片中還有設置了3個檢測實驗質量的對照。圖2為PCR芯片模式圖。由于每種芯片都是根據特別的信號通路或者特定的應用范圍設計的，研究者可以用它來研究自己感興趣的一組基因，一個生物學通路或者某種疾病狀態。PCR芯片所研究的基因范圍相對集中，大大節省了在數據分析方面所花費的時間，相對更簡潔針對性更強的信息也有利于接下來的更深入更準確的研究。因此，研究者使用PCR芯片，可以在更短的時間內得到更豐富的信息。此外，Superarray將相關基因設計在同一張PCR芯片內，為實驗準備階段也提供了方便。

圖二 PCR芯片示意圖 A1-G12孔包含了同一信號通路或者疾病的84個相關基因的引物（gene 1- gene 84）

H1-H5孔包含了5個看家基因（HK1-HK5），用于芯片數據的標準化。H6為基因組DNA參照（GDC），其中固定的引物能特異性的檢測非轉錄的基因組DNA重復片段，從而檢測樣品中是否存在DNA污染。H7到H9是三個重復的孔，均為反轉錄參照（RTC），用于檢測RT反應的效率。H10到H12是陽性PCR參照（PPC），反映了PCR反應的效率。這些孔中加入了人工合成的DNA序列和相應的引物對。兩組重復的對照RTC和PPC也可以用于檢測芯片間和芯片內的一致性。 

預設計的信號通路特異性PCR芯片

96孔模式的RT²ProfilerPCR芯片根據SuperArray的Pathway-Centric ^TM原理設計，將現有的重要信號通路研究進展與PCR芯片方法結合，是檢測信號通路提供獨特的研究工具。在設計PCR芯片時，Superarray公司綜合了文獻資料，數據庫信息，專家意見和用戶反饋，不斷根據客戶需要開發新產品，并使芯片中所包含的基因更完整，更精確。在目前的市場中，SuperArray所提供的信號通路范圍zui廣，并且有針對人，小鼠和大鼠的PCR 芯片產品（參見表1以及產品目錄）。在芯片設計中，還整合了預測資料和實驗結果，幫助研究者系統地有針對性的開展研究。這些預設計的PCR芯片，分類詳細，針對性強，使研究者無需自己一一挑選基因，節省大量時間和精力，實驗過程簡便快速，大大推進了生命科學研究進展。目前，預設計的PCR芯片涵蓋了細胞凋亡，炎癥反應，信號傳導，癌癥以及其他疾病等廣泛的生物學通路和疾病。詳細的芯片列表請登陸公司查詢。

表1 SuperArray 提供的PCR Array產品舉例

訂制的PCR芯片

如果現有的產品無法滿足研究者的特定需要，SuperArray還可以提供從設計到芯片生產的完整服務，為研究者提供使用先進的PCR芯片的便捷服務。客戶訂制芯片服務為研究者提供以下便利：1）在使用表達譜基因組芯片后，對從基因組水平篩選出來的一組基因進行驗證；2）在現有產品的基礎上作適當調整以適應特殊需要；3）完全從頭設計，適用于在現有的預設計PCR芯片中尚未包括的某個信號通路或者一組基因。若研究基因數目少于84個，還可以將96孔PCR芯片進一步分成更小的形式，從而可以在一次PCR反應中研究多個樣品。或者進行多次重復。

有了這些產品和服務，研究者在利用這項新技術時，可以專注于研究自己所感興趣的特定基因組合時，實驗中也更加省時省力。

PCR 芯片實驗體系

   完整的PCR芯片實驗體系包括RT²Profiler^TM PCR芯片，RT² Real-Time^TM SYBR Green PCR反應體系和cDNA合成試劑盒。所有這些組分均為基于SYBR Green的實時定量PCR反應優化。精心設計的引物和優化的PCR反應體系一起，為PCR芯片的特異性提供保證。在反應體系中還加入了指示染料，用于檢測PCR反應平臺的可靠性。

RT² PCR引物和RT² Real-Time^TM SYBR Green PCR反應體系

采用PCR芯片開展研究，技術上的難點是如何在同一次實驗中，相同的PCR反應條件下保證不同的基因有相近的擴增效率，并且獲得與單個基因實時定量PCR反應相當的靈敏度，特異性和可重復性。為此，SuperArray首先設計篩選出zui佳的候選引物，接著通過實驗，在不同反應條件下，檢測PCR反應體系與幾千條PCR引物的組合，zui終獲得了優化的引物和PCR反應體系，適應PCR芯片的要求。 

RT²Profiler^TM PCR芯片引物的特點

通過計算機分析和實驗驗證，引物達到以下要求：

1.特異性：通過BLAST等比對方法，檢測確認引物在相應物種（人，小鼠或大鼠）全基因組中的高度特異性，有效避免非特異性產物產生。并通過實驗證明引物不會擴增E.coli基因組，后者是Taq DNA多聚酶的常見污染源。

2.均一性：所使用的引物的CG含量，解鏈溫度（Tm），以及其他一些化學的和物理的特性都相似，以保證在相同的PCR條件（尤其是相同退火溫度）下，芯片中的不同的基因都能擴增出特異性產物。

3.擴增效率：引物擴增的片段大小均在100到200bp左右，確保在相同的反應時間內，不同的基因均能擴增出完整片段；并增強引物3’ 端的鉚定能力，減少引物二聚體和非特異性退火的發生。

RT²Profiler^TM PCR芯片PCR反應體系的特點

在基于SYBR Green的實時定量PCR反應中，PCR反應體系也起到重要作用。嚴格控制的熱啟動Taq酶是一個關鍵因素。RT² Real-Time^TM PCR反應體系采用了一種獨特的，經過化學修飾的熱啟動Taq酶，只有在熱激步驟之后，酶的活性才能完全發揮。在嚴格控制反應條件的情況下，在較低溫度下發生的非特異性引物結合無法進一步擴增。其他的反應體系則常常將這些模板進一步擴增成為非特異性產物，造成假陽性結果。此外，Superarray還對RT² Real-Time^TM PCR反應體系中的化學組分進行優化，進一步減少了引物二聚體的形成，并能保證zui難擴增的片段都得到極高的擴增效率。PCR芯片結合了高質量的PCR引物設計和RT² Real-Time^TM PCR反應體系，為PCR的高芯片質量提供了保證。

表格2總結了RT²Profiler^TM PCR芯片的特點。

表2  RT²Profiler^TM PCR芯片的特點

RT²Profiler^TM PCR芯片特點靈敏度

研究者總是希望能檢測到表達量相當低的基因，有時候，研究者得到的起始總RNA量也很少，但仍希望能進行實時定量PCR檢測。為了滿足研究者的這些需要，Superarray嚴格檢測了PCR芯片系統的靈敏度。例如，Superarray使用PCR芯片檢測了一系列總RNA樣本，這些樣本的濃度都不相同，使用的PCR芯片為炎癥細胞因子和受體基因芯片，通常，這些基因的表達量都是很低的。圖3將陽性信號的比例（Ct<35的基因所占百分比）與相應的總RNA量對應起來作圖。結果表明，當起始的總RNA范圍在5.0ng到1.0ug（甚至是5.0ug）時，每張PCR芯片的陽性信號比率均超過85%。對于表達量更高的基因，芯片檢測的靈敏度還會大大提高，即在起始RNA量更低的情況下，芯片能夠檢測到的陽性信號比例更高。值得注意的是，起始的總RNA量zui好不要低于0.5-1.0ug，否則會造成陽性信號損失。由于陽性信號比例在起始RNA量低時會顯著下降，所以在實驗中，檢測的zui低RNA量不少于5.0ng。

圖3 當總RNA量低至5.0ng時，使用RT²Profiler^TM PCR芯片實驗體系仍能獲得很高的陽性信號比例。

RNA樣品為XpressRef^TM人總RNA（GA-004），起始RNA量分別為0.1，1.0，5，10，50，100和1000ng）。芯片為炎癥細胞因子和受體PCR芯片（APHS-011A）。采用RT² Real-Time^TM SYBR Green / 熒光素PCR反應體系（PA-011）。陽性信號的比例（Ct<35的基因所占的百分比）與對應的總RNA量做圖。

特異性

PCR芯片體系的設計和優化都是針對基于SYBR green的實時定量PCR反應。由于SYBR Green與非特異的雙鏈DNA也會發生反應，為了獲得高特異性，需要保證引物只擴增出特定的目的片段，從而使基于SYBR Green的PCR芯片能夠準確的檢測基因表達水平。Superarray通過實驗對設計合成的引物進行了驗證，保證引物擴增的產物是單一的，基因特異性的，沒有引物二聚體，也沒有非特異性擴增產物。 

下面是一個檢測PCR芯片特異性的實驗。檢測PCR芯片中TGFβ和骨形成蛋白（BMP）家族各基因的熔解曲線，并且對PCR產物進行凝膠電泳實驗，該家族的基因同源性很高。圖4顯示了BMP基因家族各基因擴增產物的熔解曲線和電泳結果。如圖所示，各熔解曲線均為單峰，電泳條帶亦單一，并且條帶大小與預期值一致。結果表明， PCR 芯片擴增出基因產物特異性高，即使相同RNA樣品中同一基因家族的同源基因也可以區別。優化的體系在SYBR Green檢測中表現出高特異性，而這種特異性通常被認為只能在使用更加昂貴的基于探針的方法才能獲得。

圖4 PCR芯片的高特異性  RT²Profiler^TM PCR芯片對所檢測的基因顯示出高特異性

RNA樣品為XpressRef^TM人總RNA（GA-004，5ug），PCR芯片為人TGFb/BMP信號通路PCR 芯片（APH-035A），采用RT² Real-Time^TM SYBR Green / 熒光素PCR反應體系（PA-011）。通過標準熔解反應步驟獲得熔解曲線（A），產物進一步通過瓊脂糖凝膠電泳檢測（B）。

重復性

實時定量PCR的定量特性使得PCR芯片的重復性強。為檢測重復性，2位研究者采用了同樣的總RNA樣品，分別進行了4次重復試驗。兩個人使用同種PCR芯片，但批號不同，并且每個人都分兩天進行試驗。比較兩位研究者分別做的4張芯片的原始Ct值。圖5顯示了比較結果的圖示和相關系數。每一組比較結果均獲得理想的曲線，斜率為1.0，相關系數均不小于0.99。結果顯示，PCR芯片實驗體系的重復性高，不同批次的芯片，不同時間進行實驗，不同的重復設計，在原始值水平都能獲得很高的重復性。

圖5 PCR芯片的重復性  PCR芯片具有高重復性

RNA樣品為XpressRef^TM人總RNA（GA-004，5.0ug），PCR芯片為人藥物代謝PCR 芯片（APH-022A），采用RT² Real-Time^TMSYBR Green / 熒光素PCR反應體系（PA-011）。兩位不同的研究者分別進行了4次重復。A圖比較了原始的Ct值。B的表格則說明A中每組比較獲得的曲線的相關系數。

由于PCR芯片在技術上具備很高的重復性，在確保RNA樣品制備良好，PCR芯片實驗操作正確的情況下，所觀察到的基因表達水平的差異都是所研究的樣本本身的生物學特征所引起的，而不是由于實驗技術所造成的差異。表3總結了RT²Profiler^TM PCR芯片的特點。

表3  RT²Profiler^TM PCR芯片的特點

總結：

RT²ProfilerPCR芯片是研究一組特異性基因表達水平的理想方法。基于SYBR green 的實時定量PCR方法，適用面廣，簡單方便，使PCR芯片具有廣泛的應用前景。選擇合適的芯片模式和相應的反應體系，即可開展PCR芯片實驗。芯片包括預設計的通路特異性PCR芯片或者客戶訂制PCR芯片。PCR芯片具有與實時定量PCR相當的靈敏度，特異性和重復性。PCR芯片的設計思路，使實驗設計和實際完成實驗的時間大大縮短，對結果的分析也更直接有效。使用PCR芯片，每張芯片使用的總RNA樣品量zui少可低至0.5ng，zui多則可達到5.0ug。PCR芯片的特異性保證擴增產物的*性和基因特異性。因此，檢測得到的基因表達水平差異真實的反映了所要研究的基因的情況。PCR芯片的重復性（intra-lab的相關系數為0.99）保證實驗結果是可重復的。RT²ProfilerPCR芯片結合了實時定量PCR的優點和芯片的高通量，是研究者開展研究的得力工具。