核酸分離與純化的設計與原則

細胞內的核酸包括DNA與RNA兩種分子，均與蛋白質結合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA與蛋白質結合成脫氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA與蛋白質結合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。其中真核生物的DNA又有染色體DNA與細胞器DNA之分。前者位于細胞核內，約占95%，為雙鏈線性分子；后者存在于線粒體或葉綠體等細胞器內，約占5%，為雙鏈環狀分子。除此之外，在原核生物中還有雙鏈環狀的質粒DNA；在非細胞型的病毒顆粒內，DNA的存在形式多種多樣，有雙鏈環狀、單鏈環狀、雙鏈線狀和單鏈線狀之分。DNA分子的總長度在不同生物間差異很大，一般隨生物的進化程度而增長。如人的DNA大約由3.0×109個堿基對（base pair, bp）組成，與5 243bp的猿猴病毒（simian virus 40, SV40）相比，其長度約為后者的5.7×105倍。相對來講，RNA分子比DNA分子要小得多。由于RNA的功能是多樣性的，RNA的種類、大小和結構都較DNA多樣化。DNA與RNA性質上的差異決定了兩者的zui適分離與純化的條件是不一樣的。

一、材料與方法的選擇

（一）材料與方法的選擇
臨床常見的標本有血液、尿液、唾液、組織及培養細胞等；核酸分離與純化的方法非常多，如何恰當地收集與準備材料，選擇適宜的分離與純化方法是一個首要的問題。首先我們應當明確核酸的分離與純化并不是zui終的目的，不同的實驗研究與應用對核酸的產量、完整性、純度和濃度可能有不同的要求；至于分離與純化核酸所需的時間與成本也往往需要考慮；在不影響核酸質量的情況下，應選擇安全無毒的試劑與方案。近年來，有關試劑盒的開發與自動化儀器的使用，能批量制備核酸樣品，大大提高了分離與純化的效率。
（二）選擇的原則
核酸分離與純化的方法很多，應根據具體生物材料的性質與起始量、待分離核酸的性質與用途而采取不同的方案。無論采取何種方法，都應遵循總的原則：一是保證核酸一級結構的完整性，因為完整的一級結構是核酸結構和功能研究的zui基本的要求；二是盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度，這是本章討論的主要內容。
（三）核酸完整性的保持
為了保證核酸的完整性，在操作過程中，首先應盡量避免各種有害因素對核酸的破壞。影響核酸完整性的因素很多，包括物理、化學與生物學的因素，其中有些是可以避免的。如過酸或過堿，對核酸鏈中的磷酸二酯鍵有破壞作用，在核酸的提取過程中，采用適宜的緩沖液，始終控制pH在4～10之間，就可以很好地避免其危害；另外如高溫加熱，除高溫本身對核酸分子中的化學鍵的破壞作用外，還可能因煮沸帶來液體剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的條件下進行。
其次對無法避免的有害因素，應采取多種措施，盡量減輕各種有害因素對核酸的破壞。應盡量簡化分離純化的步驟，縮短提取的時間，減輕各種有害因素對核酸完整性的破壞； DNA酶（DNase或DNAase）的激活需要Mg2+、Ca2+等二價金屬離子，若使用EDTA、檸檬酸鹽并在低溫條件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶（RNase或RNAase）的廣泛存在與不易失活的特點，決定了生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素。

二、技術路線的設計
（一）核酸的釋放
正常情況下，無論是DNA還是RNA均位于細胞內，因此核酸分離與純化的*步就是破碎細胞、釋放核酸。細胞的破碎方法非常多，包括機械法與非機械法兩大類。機械法又可分為液體剪切法與固體剪切法。機械剪切作用的主要危害對象是高分子量的線性DNA分子，因此該類方法不適合于染色體DNA的分離與純化。非機械法可分為干燥法與溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用適宜的化學試劑與酶裂解細胞的溶胞法因裂解效率高，方法溫和，能保證較高的得率與較好地保持核酸的完整性而得到了廣泛的應用。
（二）核酸的分離與純化
細胞裂解物是含核酸分子的復雜混合物，核酸分子本身可能仍與蛋白質結合在一起。在保證核酸分子完整性的前提下，要從中分離出一定量的、符合純度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，這需要我們在對核酸分子有關性質的充分認識的基礎上，利用核酸與其它物質在一個或多個性質上的差異而設計有效方案加以分離。這種差異是多方面的，包括細胞定位與組織分布上的差異、物理化學性質上的不同以及各自獨特的生物學特性。應該去除的污染物主要包括三個部分：即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分離純化過程中加入的對后繼實驗與應用有影響的溶液與試劑。非核酸大分子污染物主要包括蛋白質、多糖和脂類物質等；非需要的核酸分子，是指制備DNA時，RNA為污染物，制備RNA時，DNA為污染物，制備某一特定核酸分子時，其它的核酸分子均為污染物；至于在核酸分離純化過程中加入的有機溶劑和某些金屬離子，由于對后繼實驗有影響，往往需要很好地去除。
（三）核酸質量與提取步驟的關系
一般地，分離純化步驟越多，核酸的純度也越高，但得率會逐漸下降，完整性也愈難以保證。相反，通過分離純化步驟少的實驗方案，我們可以得到比較多的完整性較好的核酸分子，但純度不一定很高。這需要結合核酸的用途而加以選擇。
（四）核酸的濃縮、沉淀與洗滌
隨著核酸提取試劑的逐步加入，以及去除污染物過程中核酸分子不可避免的丟失，樣品中核酸的濃度會逐漸下降，及至影響到后面的實驗操作或不能滿足后繼研究與應用的需要時，需要對核酸進行濃縮。沉淀是核酸濃縮zui常用的方法，其優點在于核酸沉淀后，可以很容易地改變溶解緩沖液和調整核酸溶液至所需濃度；另外，核酸沉淀還能去除部分雜質與某些鹽離子，有一定的純化作用。加入一定濃度的鹽類后，用有機溶劑沉淀核酸。其中常用的鹽類有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂等，常用的有機溶劑則有乙醇、異丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的鹽，需用70%～75%的乙醇洗滌去除。對于濃度低并且體積較大的核酸樣品，可在有機溶劑沉淀前，采用固體的聚乙二醇或丁醇對其進行濃縮處理。 

三、鑒定、保存與應用

（一）核酸的鑒定
1．濃度鑒定 核酸濃度的定量鑒定可通過紫外分光光度法與熒光光度法進行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的堿基均具有一定的紫外線吸收特性，zui大吸收波長在250nm～270nm之間。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其zui大吸收波長不變。由核苷酸組成核酸后，其zui大吸收波長為260nm，該物理特性為測定溶液中核酸的濃度奠定了基礎。在波長260nm的紫外線下，1個OD值的光密度大約相當于50μg/ml的雙鏈DNA，38μg/ml的單鏈DNA或單鏈RNA，33μg/ml的單鏈寡聚核苷酸。如果要精確定量已知序列的單鏈寡核苷酸分子的濃度，就必須結合其實際分子量與摩爾吸光系數，根據朗伯-比爾定律進行計算。若DNA樣品中含有鹽，則會使A260的讀數偏高，尚需測定A310以扣除背景，并以A260與A310的差值作為定量計算的依據。紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
（2）熒光光度法：熒光光度法以核酸的熒光染料溴化乙錠（ethidium bromide，EB）嵌入堿基平面后，使本身無熒光的核酸在紫外線激發下發出橙紅色的熒光，且熒光強度積分與核酸含量呈正比。該法靈敏度可達1ng～5ng，適合低濃度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold作為一種新的超靈敏熒光染料，可以從瓊脂糖凝膠中檢出低于20pg的雙鏈DNA。
2．純度鑒定 紫外分光光度法還是熒光光度法，均可用于核酸的純度鑒定。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質的污染。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA的A260/A280比值為2.0。比值升高與降低均表示不純。其中蛋白質與在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白質的紫外吸收峰在280nm與酚在270nm的高吸收峰可以鑒別主要是蛋白質的污染還是酚的污染。RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值為1.8的DNA溶液不一定為純的DNA溶液，可能兼有蛋白質、酚與RNA的污染，需結合其它方法加以鑒定。A260/A280的比值是衡量蛋白質污染程度的一個良好指標，2.0是高質量RNA的標志。但要注意，由于受RNA二級結構不同的影響，其讀數可能會有一些波動，一般在1.8～2.1之間都是可以接受的。另外，鑒定RNA純度所用溶液的pH值會影響A260/A280的讀數。如RNA在水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris緩沖液（pH 7.5）中的讀數低0.2～0.3。
（2）熒光光度法：用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結果可用于判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA大許多，電泳遷移率低；而RNA中以rRNAzui多，占到80%～85%，tRNA及核內小分子RNA占15%～20%，mRNA占1%～5%。故總RNA電泳后可呈現特征性的三條帶。在原核生物為明顯可見的23S、16S的rRNA條帶及由5S的rRNA與tRNA組成的相對有些擴散的快遷移條帶。在真核生物為28S、18S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA構成的條帶（圖6-1）。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不見的。通過分析以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結果，我們可以鑒定DNA制品中有無RNA的干擾，亦可鑒定在RNA制品中有無DNA的污染。
3．完整性鑒定 常規使用凝膠電泳法。
（1）凝膠電泳法：以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結果可用于判定核酸的完整性。基因組DNA的分子量很大，在電場中泳動很慢，如果有降解的小分子DNA片段，在電泳圖上可以顯著地表現出來。而完整的無降解或降解很少的總RNA電泳圖，除具特征性的三條帶外，三條帶的熒光強度積分應為一特定的比值。沉降系數大的核酸條帶，分子量大，電泳遷移率低，熒光強度積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強度積分低。一般28S（或23S）RNA的熒光強度約為18S（或16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解。如果在加樣槽附近有著色條帶，則說明有DNA的污染。
（2）其它方法：必要時，還可以通過一些特殊的試驗來分析RNA的完整性，如小規模的*鏈cDNA合成反應、以放射性標記的寡脫氧胸苷酸oligo(dT)為探針的Northern雜交以及對已知大小的mRNA的Northern雜交。另外，隨著毛細管電泳與生物芯片技術的飛速發展，有關核酸的分離、純化、鑒定與回收的手段日益豐富。
（二）核酸的保存
核酸的結構與性質相對穩定，無需每次制備新鮮的核酸樣品，且一次性制備的核酸樣品往往可以滿足多次實驗研究的需要，因此有必要探討核酸的貯存環境與條件。與分離純化一樣，DNA與RNA的保存條件也因性質不同而相異。
1．DNA的保存 對于DNA來講，溶于TE緩沖液在-70℃可以儲存數年。其中TE的pH值為8，可以減少DNA 的脫氨反應而pH低于7.0時DNA容易變性；EDTA作為二價金屬離子的螯合劑，通過螯合Mg2+、Ca2+等二價金屬離子以抑制DNA酶的活性；低溫條件則有利于減少DNA分子的各種反應；雙鏈DNA因結構上的特點而具有很大的惰性，常規4℃亦可保存較長時間；在DNA樣品中加入少量氯仿，可以有效避免細菌與核酸的污染。
2．RNA的保存 RNA可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液或雙蒸消毒水中，-70℃至-80℃保存。若以焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白（RNasin）或氧釩核糖核苷復合物（vanadyl-ribonucleoside complex，VRC），則可通過抑制RNA酶對RNA的降解而延長保存時間。另外，RNA沉淀溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可于-20℃長期保存。其中，甲酰胺溶液能避免RNase對RNA的降解，而且RNA極易溶于甲酰胺溶液，其濃度可高達4mg/ml。需要注意的是，這些所謂RNA酶抑制劑或有機溶劑的加入，只是一種暫時保存的需要，如果它們對后繼的實驗研究與應用有影響，則必須予以去除。
由于反復凍融產生的機械剪切力對DNA與RNA核酸樣品均有破壞作用，在實際操作中，核酸的小量分裝是十分必要的。
（三）核酸的應用
分離純化的核酸樣品，既可用于核酸本身功能與性質的研究，亦可利用其功能與性質進行廣泛的應用，如基因工程與蛋白質工程均以核酸分子作為原始材料。可以說，目前包括聚合酶鏈反應，核酸的分子雜交與DNA重組與表達技術在內的絕大多數分子生物學技術，都是以核酸分子為處理對象，利用核酸分子的堿基配對原理與核酸的一種或多種酶修飾性進行的。絕大多數分子生物學技術，實質上是對DNA和RNA的分析。沒有核酸的分離與純化，分子生物學技術就沒有研究與應用的基礎。