磷酸鈣介導的真核細胞轉染實驗——高效轉染法

真核細胞

完全培養液TEBES

培養箱平板

1.  轉染前一天接種呈指數生長的細胞，密度為5×10⁵/10 cm  平板。加10 ml 完全培養液，在開始轉染時細胞數應＜10⁶/平板，以留足夠供細胞擴增至少2倍的表面積。

2.  用TE緩沖液稀釋質粒DNA至1 μg/μl ，4 ℃保存。

3.  將最適量的質粒DNA與500 μl 0.25 mol/l CaCl₂混合，加入500 μl 2×BBS中，混勻，室溫下溫育10~20 min。

4.  將磷酸鈣-DNA溶液逐滴加入培養皿的細胞中，同時晃動培養皿，在35℃ 3%CO₂培養箱中溫育15~24min。

5.  用5 ml PBS洗細胞兩次，加入10 ml 完全培養液。對于穩定轉化，在35~37℃ 5%CO₂培養箱中培養過夜。對于短暫表達，培養細胞48~72 h。

6.  在開始選擇穩定的轉化細抱前按1：10至1：30分傳細胞。于35~37℃培養箱中培養過夜。

7.  將培養液換成選擇培養液，或在適當的選擇條件下培養細胞進行選擇穩定的轉化子。