cDNA文庫的構建3

階段 5:SepharseCL-4B 凝膠過濾法分離 cDNA

材料

緩沖液和溶液

乙醇

乙酸鈉（3 ml/L,pH5.2)

TE(pH7.6)
含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)

Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)

凝膠

瓊脂糖凝膠（1%)
見步驟 8。

核酸和寡核苷酸

cDNA
階段 4 中步驟 13 及 14 制備的 cDNA。

DNA 參照物
DNA 參照物應為末端標記的片斷，長度 200bp~5kb。

專用設備

過濾的壓縮空氣

止血器或軟管夾

帶有彎頭的皮下注射針頭

1 ml 無菌吸管

聚乙烯管

剪刀

Sepharose CL-4B
用含有 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 對市售糊狀 Sepharose CL-4B 清洗數次。這種清洗可以去除存留在某些批號凝膠中的連接抑制劑。Amershan Pharmacia 生物技術公司提供已經裝填好的 Sepharose CL-4B 柱 (Sizesep400 離心柱)。

乙烯基泡沫管

Whatman3 MM 濾紙

方法

Sepharose CL-4B柱的制備

1. 用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進1 ml滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。

2. 將一段無菌的聚氯乙烯軟管（通常用于蠕動泵的管型）與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1mol/LNaCl 的TE(PH7.6)溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內充滿緩沖液，用止血鉗關閉軟管。

3. 在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，0.1mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)平衡了的SepharoseCL-B填充于泡沫管，讓糊狀物靜置數分鐘，放開止血鉗，當緩沖液從吸管滴落時，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的SephamseCL-4B, 直至填充基質幾乎充滿吸管為止。

柱子直徑應約為 27x0.3 cm。

4. 將幾倍柱床體積的含0.1mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關閉柱子底部的軟管。

依據大小分離回收DNA

5. 用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50ul或更小)，放開止血鉗，使 cDNA進入凝膠。用50ul TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA 的微量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1mol/LNaCl的TE(pH7.6)充滿泡沫管。
重要: 任何時候都不可使柱子流干！

6. 用手提式小型探測器監測cDNA流經柱子的進程。放射性cDNA流到柱長2/3時，開始用微量離心管收集，每管二滴（約60ul), 直至將所有放射性洗脫出柱為止。

7. 用切侖科夫（Cerenkov)計數器測量每管的放射性活性。

8. 從每一管中取出一小份（約以末端標記的已知大小（0.2kb~5kb)的 DNA片斷作標準參照物，通過1% 瓊脂糖凝膠電泳進行分析，將各管余下部分貯存于-20°C，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。
制備的瓊胞糖凝膠應盡可能薄以便加快電泳完成后干燥的過程。
標準DNA參照物中放射性量應是cDNA峰值放射性量的 30%。

9. 電泳后將凝膠移至一張Whatman3 MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干燥器（市售）上干燥。干燥過程前20 min至30 min于 50°C加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態繼續干燥l~2 h。

10. 置-70°C加增感屏對干燥的凝膠繼續X射線片曝光。
柱洗脫早期收集的部分，放射性自顯影應顯示cDNA大小為5~7kb的片狀放射性：隨后收集的 cDNA越來越小。

11. 在cDNA長度>500bp 的收集管中，加入 0.1 倍體積的3mol/L 乙酸鈉（pH5.2) 和二倍體積的乙醇。于 4°C 放置至少 15 min 使cDNA 沉淀，用微量離心機于 4°C 以 12000 g 離心 15 min, 以回收沉淀的 cDNA。
選擇分級收集一定要十分謹慎，切不可選取含有痕量小于500bp 的cDNA的收集管。否則，文庫中將含有數量很大的短 cDNA 鏈克隆。

12. 將 DNA 溶于總體積為20ul的 10 mmol/LTris-HCl(pH7.6) 中。

13. 測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于與噬菌體臂相連接的DNA 總量 (有關 cDNA 第二鏈的計算，參見階段 2 步驟 8)。

如果一切順利，10ug poly(A)RMA 至少可產生 250~400ng(可能髙至 3ug) 的長度大于 500bp 的 cDNA。

階段 6:cDNA 與λ噬菌體臂的連接

材料

緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到合適濃度。

ATP(10 mmol/L)

SM

酶和緩沖液

噬菌體 T4DNA 連接酶